1、 DNA提取方法简介提取方法简介q 基因组基因组DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它q 非基因组非基因组DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取经典方法）提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。物。具有从2、低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植3、物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白（脱氧核糖核蛋白 ）。）。CTAB溶解细胞膜4、，溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，5、有效去除多酚，减少的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。和多糖结合，有效去除多糖。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）（聚乙烯吡咯烷酮）lPVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的值表示，不同的K值分别代表相应的值分别代表相应的PVP平均分平均分子量范围。子量范围。K值实际上是与值实际上是与PVP水溶液的相对粘度水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用物理量，因此可以用K值来表征值来表征PVP的平均分6、子量。的平均分子量。通常通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。值越大，其粘度越大，粘接性越强。l l在研磨过程中加入在研磨过程中加入PVP，其中的，其中的CO-N=基有很强的基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。会。l同时向抽提液中加入还原剂同时向抽提液中加入还原剂-巯基乙醇，后者能打巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。后经抽提而去除。 qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解7、干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q SDS法原理法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐提高盐(KAc或或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份组份Tris-HCl （pH8.0）EDTA 8、（pH 8.0 ）NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。3.加入150ul 的5mol/ LKac, 混匀, 冰浴15min 左右q SDS SDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例） 动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液 物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法 化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍9、法、碱裂解法 生物方式生物方式：酶法：酶法q根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：吸附材料结合法：吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。物，从而达到分离目的。浓盐法浓盐法：10、有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物q碱裂解法原理碱裂解法原理 染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子； 当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时，线状染色体11、溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象； 变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒12、精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液SDS碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNA中溶液中溶液1的成分的成分及作用及作用 l溶液溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去 l溶液溶液 0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 l溶液溶液III 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸 l这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的13、Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀 q煮沸法原理煮沸法原理 染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子； 当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢复其天然14、构象； 变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。q差速离心法原理差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得15、以分离。从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。种组分分级分离出来。I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲16、液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中最好使用新鲜材料，低温保最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长，否则会造成否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少，提取前先富集少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则培养时应17、加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）严谨性质粒和松弛性质粒l按照复制性质，可以把质粒分为两类：l一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；l另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在18、变形杆菌内则属松弛型。 材料应适量，过多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮体在悬浮液中充分悬浮变性19、的时间不要过长（变性的时间不要过长（5分钟），分钟），否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会复性时间也不宜过长，否则会有基因组有基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁用酶法或机械法处理，以破壁采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕猕猴桃大提，猴桃大提，10000转转2020、min）针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取q 蛋白质的去除：蛋白质的去除： 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤高盐洗涤 蛋白酶处理蛋白酶处理q 多糖的去除：多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将21、多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积) )，氯苯可，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。q 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半22、胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合q 盐离子的去除：盐离子的去除： 7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于），有利于充分沉淀充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，23、以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子1.1.重24、新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）质（具体方法见前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原原因因对对策策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料