细胞实验培养基拿出操作台贴封口膜有影响吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-10-15 12:56 标签： 细胞培养瓶透气盖

将分纯的待存菌接种于适宜的固体斜面培养基上，得到充分生长后，用封口膜封口，贴上标签，保存于4℃的冰箱中。此法操作简单、使用方便、不需要特殊设备，是实验室菌种保存最常用的方法。但保存时间短，一般每个月都要移种1次，而且菌种容易变异，所以此方法只适合实验室短期实验菌株的保存。

用接种针将以分纯的待存菌，穿刺接种于半固体中，放入培养箱培养后出，封上无菌的液体石蜡，贴上标签，放4℃冰箱保存。此方法简便易操作，不需特殊设备、技术难度不大，但保存的时间不长，一般只能保存1年以内，而且对抵抗力弱以及一些特殊菌种大概只能存活3～6个月，需要频繁的传代，这样很容易使菌株受到污染、变异。所以此方法不适用菌种的长期保存，只适合实验室一些要求不高的菌种的短期保存。

将液体石蜡灭菌，放于37℃恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将已分纯的待存菌在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，用量以高出斜面1cm为准，将试管直立，贴上标签，置4℃下保存。此法制作简单，不需要特殊设备，菌种可以保存1年左右不需要经常移种，缺点是保存的时候需要直立放置。此方法适合实验室短期保存，而且保存时需要一定的空间。

4.高层半固体琼脂石蜡保存法

将待存菌经平板划线分离后，挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高固体琼脂培养基中，经培养箱培养后取出，用灭菌过的液体石蜡滴加到半固体琼菌种管表层约0.5cm高度，贴上标签，存放4℃冰箱。此法操作简便，不需要特殊设备，效果好，可以保存菌株1～2年。所以适合实验室菌株的较长期的保存。

将已分纯的待存菌用无菌镊子镊取纸片，在纸片上刮取4～5个菌落，入冻存管内，盖上盖子后用封口胶布封住边缘，贴上标签，放入冰箱冷冻保存(－20℃左右)。此方法具有操作简单、不需特殊设备、经济实用、保存空间小等而且保存时间至少2年，但对一些营养要求比较高的菌种，存活率不理想。所以方法适合实验室一些营养要求不高的菌种较长时间的保存。

将已分纯的待存菌接种于肉汤中，37℃培养18～24h，然后按5份肉汤溶液、2份甘油－生理盐水保存液的比例分装于灭菌的微量离心管或细胞冻存管中，贴上标签，置－80℃～－20℃冰箱保存。此法操作简便，不需要特殊设备，效果好，可以保存菌种3年左右，无变异现象，而且此方法还可以保存一些要求较高的特殊菌种，适用范围广。所以此方法适合实验室普通菌种或特殊菌种的较长期的保存。

科研狗做了一天的实验，本来高高兴兴。
实验试剂，复核，完美！
实验步骤，复核，完美！
实验仪器，复核，也完美！

难道，这就是传说中的水逆！？

科研狗都知道水逆是个玄学，但有时候水逆宝宝表示

那么到底是哪里出了问题呢？其实有时候我们在取样和样本保存的时候，一些细节问题没注意到，那么就会导致整个实验所有的努力白费。特别是一些刚进实验室的熊孩子们，一顿操作猛如虎，一看结果全是哭！

好了，好了，小拓今天就来整理一下，一些常规实验样本保存方法及注意事项，包括：分子实验、蛋白实验、病理实验、透射电镜、生化检测。

一、分子实验（RNA/DNA）

组织取材在组织离体 30min 内完成，取样的动作要尽量快速利索，将组织切成任一方向小于 0.5 cm 的薄片（尽可能剪碎），抽取 1ml trizol 溶液于 2ml冻存管内，将样本完全浸没于trizol溶液(如0.4g样本需要约2.0 mLtrizol的溶液)。
液氮速冻后，-80 度保存。

注意：为完全有效的保护组织样本，该组织样本应完全浸没入 trizol 溶液中并且组织样本的任何一边的最大厚度不应超过 0.5 cm。

细胞收集后用PBS缓冲液快速洗一次，每5×106个细胞加入1 ml trizol，用枪头反复抽打，直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；液氮速冻，-80 ℃保存。

1）加入1 ml TRIzol和 200-300μL新鲜血液（TRIzol：血液 = 3：1-5：1），用移液器吹打几次以帮助裂解样品中的细胞；
2）样品剧烈震荡混匀1~2 min，直到絮状物全部溶解；
3）室温孵育5 min以使核蛋白体完全分解；
4）写好编号，封口膜封存，-80 ℃冻存。

注意：冰冻血液溶解过程中会有破碎的细胞释放RNA酶，因此建议在冰冻前加入TRIzol，切勿直接冻存新鲜血液，保存好的血液应避免反复冻融。

（1）组织样本：取材后，PBS清洗2-3次，液氮速冻， -80 ℃保存
（2）细胞样本：细胞收集沉淀后，液氮速冻， -80 ℃保存

组织样本：取新鲜组织，用无尘纸快速吸去血液，将组织剪成小块，放入装有液氮的锡箔纸中速冻后，放入液氮预冷的离心管中，液氮速冻5min后，-80度保存。

细胞样本：收集细胞悬浮液于1.5ml的离心管中，离心去上清，PBS洗涤三次，液氮速冻5min后，-80 ℃保存。

血清样品：收集全血，室温放置2h，4℃ 3000rpm/min 离心10min，吸取上部的血清即可，-80度保存。

全血：新鲜抗凝血，避免剧烈震荡，避免凝血；立即提取。

组织样本：取材后，PBS 清洗 2-3 次，使用 4% PFA 固定，组织样本需完全浸泡在固定液中，固定液的容量应足够，一般固定液与组织块的体积比率应大于 10:1。室温保存。

注意：取材样本要新鲜，否则细胞内溶酶体会破裂，造成细胞自融。

细胞样本：细胞爬片后，4% 

保存条件（所有固定标本切勿冷冻结冰）
眼球（观察目的视网膜，视盘，眼角膜）
bouin's固定液固定24h以内转移至75%酒精保存运输
消化离心收集细胞沉淀最少绿豆大小，PFA固定
灌洗液，细胞悬液，骨髓液，腹水，尿液等较稀的样品瑞士吉姆萨染色 离心收集细胞沉淀，甲醇重悬固定
血管大体油红染色（目的：染血管内膜脂肪斑块沉积情况）
5cm左右的肠段，PFA固定

取新鲜组织，PBS清洗2-3次后，立即用OCT包埋，-80度固定/保存。或者新鲜组织，PBS清洗后，-80度保存。

保存条件（所有固定标本切勿冷冻结冰）
ros染色（染活性氧） 新鲜组织-80℃保存；
ATP染色（肌纤维分型I,II型）
TTC染色（区分梗死区和正常区）

① 1-3min内取样，取样组织2mmX2mm大小，尽量薄。如来不及修整组织大小可先于电镜固定液内固定半小时左右待组织变硬以后再修整组织进行后固定。超出此范围后组织会无法完全固定，后续实验无法完成，务必请重视此过程。

② 取材时尽量精确到需要观察的目的部位（如观察肾小球取肾皮质；观察胰岛取胰岛丰富的胰尾；皮肤，肠胃等在固定液中易打卷的组织可将组织粘在滤纸上进行固定）。

③ 取材时一定注意避免镊子挤压等机械损伤，刀片要锋利避免挫伤组织。

④ 组织取下后立即投入电镜固定液内室温固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。4℃时样本可保存1个月左右。

贴壁细胞：实验目的重点观察细胞连接，将培养好的细胞弃培养基不经漂洗迅速加电镜固定液用细胞刮沿一个方向轻轻刮下细胞收集到离心管内（避免刮破细胞）。实验目的重点观察细胞器，对细胞形态形状无特殊要求，用胰酶消化，离心收集细胞要肉眼可见细胞沉淀芝麻至绿豆大小，弃固定液后加新的电镜固定液室温固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

悬浮细胞：离心收集细胞要肉眼可见细胞沉淀芝麻至绿豆大小，弃培养基后加电镜固定液室温固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

组织样本：取新鲜组织，用PBS清洗去血液，将组织剪成小块，放入冻存管中，液氮速冻5min后， -80℃保存

血清样本：全血标本室温放置2小时3000rpm/min离心15min，-80℃保存。

血浆样本:可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8℃3000rpm/min离心15min， -80℃保存。

细胞样本:收集细胞沉淀， -80℃保存

注意：血清血浆颜色外观无差别，不备注清楚无法肉眼分辨。

血清：全血中不加抗凝剂或加促凝剂，血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黄色透明液体。

血浆：全血中加抗凝剂，血液凝固后取出的含凝血因子的淡黄色透明液体。

区别1：取血清不加抗凝剂；取血浆加抗凝剂。

区别2：血清中不含凝血因子；血浆中含凝血因子

2.实验用血清还是血浆

生化：建议优先选择血清，其次选择肝素抗凝血浆

ELISA：建议优先选择血清，其次选择肝素或EDTA抗凝血浆

凝血实验：只能选择枸橼酸钠抗凝血浆

血常规：只能选择EDTA抗凝全血

3. 不同抗凝剂对实验检测的影响

注意：有以下检测指标且需要用血浆的，请选择相应的抗凝剂

生化：EDTA对无机离子、碱性磷酸酶、肌酸激酶、超氧化物歧化酶检测有影响；常规生化检测可用肝素锂抗凝血浆。

ELISA：常规指标血清或EDTA及肝素抗凝血浆都可测，凝血相关指标需用枸橼酸钠抗凝，以具体指标为准。

凝血四项：肝素及EDTA可能导致测不出来，只能用3.2%或3.8%枸橼酸钠抗凝：全血=1:9比例抗凝。

血常规：肝素影响白细胞计数，其他抗凝或多或少影响血细胞形态，EDTA为最佳抗凝剂，最佳浓度比为1.5mgEDTA：1ml全血

最后祝大家圣诞快乐and新年快乐！

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