拉姆检测：请问有没有合成过配体为FMN的亲和胶?

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-05-24 12:55 标签： 拉姆什么水平

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适配体(aptamer)是指利用指数富集的配体进化技术(systematicevolutionofligandsbyexpo-nentialenrichment,SELEX),从特定的寡核苷酸文库中筛选获得的对目标靶有特异性相互作用的单链DNA或RNA分子。适配体可以与核酸、小肽、蛋白质、小的有机复合物甚至是整个有机体特异性结合,影响这些靶分子的性质,从而起到改变与靶分子相关的生物学功能的效果。

适配体的概念在1990年由Tuerk等首次提出,来源于拉丁语“aptus”,即“匹配”的意思,指能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸片段。研究表明,在一定环境下,单链DNA或RNA能与某些物质形成多种热力学稳定的三维空间结构而成为各种功能分子。在大多数情况下,溶液中的单链DNA或RNA的空间构象是不确定的,当有目标分子存在时,在合适的环境下寡聚单链会发生适应性折叠,形成发夹(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(bulge)、G-四分体(G-quartet)等特殊结构,通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与目标分子紧密结合[1]。研究者们在单链DNA或RNA自身形成的空间结构与目标分子高效特异结合的基础上,建立随机寡核苷酸文库,将该库中的核苷酸序列与目标分子混合,用洗脱、过滤、亲和色谱、磁性微球等方法筛选出与其特异性结合的核苷酸片段,再通过PCR进行扩增,经多个循环分离得到亲和力和特异性都最高的寡核苷酸结合序列[2]。筛选出的寡核苷酸片段被称为适配体,与适配体能进行特异性结合的目标分子称为配体(ligand)。

与传统抗体相比,适配体具有以下优点。①靶标广。适配体可以与小分子物质如氨基酸、金属离子、辅助因子FMN、核苷等结合,也可以是药物、类固醇、糖类等,甚至是完整的细胞、病毒和细菌等结合,拓宽了其应用范围。②有高亲和性和特异性。

核酸适配体只识别与其互补的分子空间结构,能够分辨出靶分子结构上的细微差别,比如相差一个甲基或一个羟基或D/L镜像体之间的区别等。同时核酸适配体与靶分子结合的解离常数(kd)可以达到纳摩尔甚至皮摩尔水平,具有比抗体或其他类型配基更高的亲和力和特异性,有的甚至高于天然配体[3],几乎可以完全避免非特异性结合。如茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似,常规的茶碱单抗与后两者有交叉反应,而核酸适配体只特异结合茶碱,与其他两种物质无反应,且与茶碱的亲和力比与咖啡因高10000倍。③可以大量、快速地在体外合成,筛选制备简单快速,结构易改造与修饰。2001年Cox等[4]成功地建立了适配体自动化筛选平台,筛选到了溶菌酶的适配体。筛选流程包括:通过链霉亲和素(SA)与生物素的相互作用将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上,随后特异结合序列的分离,RT-PCR扩增和转录都通过设定的程序自动化完成,最后将筛选得到的序列克隆到载体中进行测序鉴定。2002年又做了进一步改进[5],直接利用基因体外转录与翻译的方法产生靶蛋白。④稳定性优于抗体,利于储存。核酸适配体在亲和力和特异性方面可与抗体媲美,甚至优于抗体,并且具有抗体所不具备的其他一些优点[6]。⑤具有低免疫原性,能干扰靶蛋白质之间的相互作用。核酸适配体不具有免疫原性,预临床试验结果显示,即使应用剂量高于治疗剂量的1000倍[7],也不会引起免疫反应,没有明显的毒性和副作用。

理论上,适配体可以被用于治疗任何由有害基因的表达而引起的疾病,如病毒感染、癌增长和炎性疾病等。核酸适配体作为治疗药物的研究始于20世纪90年代,首先被证明具有治疗功能的适配体是抗血管内皮生长因子适配体,也是适配体治疗药物中最成功的一例,后来被EyetechPharmaceuticals公司和Pfizer公司共同开发为一种治疗湿性老年性黄斑变性药物,已经通过第三阶段临床试验[8]。

此后,适配体作为治疗药物在生物医学领域得到了广泛推进,并深入到各个领域,如心血管疾病治疗、肿瘤的显像和治疗、流感病毒的检测和治疗药物等各个方面。近年来,核酸适配体类抗病毒药物的筛选研究进行得尤其迅速,如通过筛选抑制A20蛋白适配体来抑制牛痘病毒的复制[9],丙型肝炎病毒RNA复制子的适配体的筛选[10]及抗HIV药物筛选等。其中,对抗HIV适配体类药物的研究最多,如Kissel等[11]通过抑制HIV-1逆转录酶制备的适配体、Hannoush等[12]通过抑制HIV-1核糖核酸酶H制备的适配体及Katahira等[13]通过抑制HIV-1Tat蛋白介导的反式激活制备的核酸适配体等。

人们设计出各种新型的生物传感器来检测金属离子、药物、核酸、蛋白质和细胞等小分子物质,并通过荧光染料、荧光共轭高聚物、纳米粒子、电化学活性探针等材料以及核酸的级数扩增特性、核酶的催化活性及镜像适配体的手性识别特性等多种形式增加检测灵敏度。基于适配体的检测技术也令人振奋,如荧光染料TOTO常温下直接与适配体混合即完成“标记”而用于靶分子检测[14],基于适配体的生物传感器可达到“无试剂、可再生、超敏感”的靶分子检测新要求[15]。McCauley等[16]以核酸适配体制成生物芯片,能同时、定量、特异地检出3种混于血清和细胞提取物中的肿瘤相关蛋白(次黄嘌呤单磷酸脱氢酶Ⅱ、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子),显示出良好的特异性和应用前景。

目前已开发了基于适配体的比色、荧光及电化学等方法,用于各种疾病相关蛋白质的检测。Wang等[17]利用硅纳米颗粒与金电极技术结合,将适配体应用到电化学生物传感器上,采用竞争模式对凝血酶蛋白进行了定量检测,检测限可达1.0×10-12mol/L。2006年我国徒永华等[18]利用凝血酶的2条核酸适配体与凝血酶的高亲和力构建了三明治结构,利用磁性纳米颗粒的磁性分离技术,设计并制作了一种新型的荧光纳米生物传感器,用其检测凝血酶,具有很高的特异性和灵敏度。由于目标分子在适配体上精确的结合位点与构象变化通常并不十分清楚,直接导致合适标记核酸适配体存在一定的难度。因此,适配体的无标记型检测技术已经成为近年来的研究热点,尤其在生物检测、环境监控等领域具有非常重要的意义。

适配体可通过与靶位点结合而影响生物体的遗传功能,适配体可以直接在转录和翻译两个水平上对基因表达产物进行调控。适配体通过对构成表达体系中的各类因子的作用,抑制或激活调控蛋白的活性来影响mRNA或蛋白质的表达量。或将适配体作为调控元件插入到表达体系中,通过适配体与靶分子结合时的变构效应,影响蛋白质最终表达,从而对蛋白质的功能进行调控。LXRs是肝中胆固醇逆向转运调节的一种重要因子,它通过干预机体内众多胆固醇调节蛋白的表达量来调节血液中胆固醇代谢。Surugiu-warnmark等[19]通过体外筛选技术筛选到一种LXRs受体抑制剂,该适配体能有效地降低LXR-α和LXR-β受体浓度,通过控制脂肪酸的合成和高密度脂蛋白的组装来调节胆固醇的合成。该适配体是一种潜在的治疗动脉粥样硬化心血管疾病药物。Charlton等[20]利用适配体结合中性粒细胞中弹性蛋白酶从而阻止其催化反应,其作用超过了此蛋白酶的天然抑制因子。而可识别凝血因子Ⅸa的RNA适配体在临床中已可替代肝素,并可通过适配体的互补序列来调控抗凝效果[21]。最近人们开发出一些与肿瘤、艾滋病、肝炎相关蛋白质的适配体,可直接用于干扰疾病的发展过程[22]。原核生物中发现的Riboswitch更是适配体参与基因表达调控的一大里程碑,该发现提示不需要蛋白质因子的参与,RNA与代谢产物结合即可调控自身的转录和/或翻译。根据这一原理,人工构建的Ribos-witch能够实现目的基因的可调控表达[23],利用Ri-boswitch特性有可能开发出新型抗生素。

3适配体在动物医学领域的应用前景

3.1动物疫病治疗中的应用

适配体在治疗动物疫病方面的研究还处在起始阶段,近年来在病毒性疾病、细菌性疾病和寄生虫病治疗方面都有了初步探索结果。病毒性疾病方面,Cheng等[24]利用SELEX技术筛选出与H5N1亚型流感病毒HA1蛋白结合的DNA适配体,对H5N1亚型流感病毒具有抑制活性;Jang等[25]在体外筛选出抑制人严重急性呼吸综合征病毒(SARS)NT-Pase/解旋酶的RNA适配体,通过抑制该病毒双链DNA的解旋来抑制病毒复制。King等[26]以纯化的朊病毒蛋白质作为靶物质,筛选到了适配体97,试验证明该适配体在脑组织匀浆中能特异性地识别和结合朊病毒蛋白质。细菌性疾病方面,江丽等[27]筛选到了与葡萄球菌肠毒素B(ESB)特异、高亲和力结合的单链DNA(ssDNA)适配体,为金黄色葡萄球菌感染的诊治奠定了基础;潘勤等[28]筛选出了针对伤寒杆菌IBV型纤毛操纵子的适配体,该适配体能显著抑制伤寒杆菌侵入THP-1细胞。这些研究成果使得开发新型预防和控制动物传染病感染的药物成为可能。

此外,在寄生虫病的防治方面,也有人进行了初步研究。非洲布氏锥虫是人与家畜易感的致命的寄生虫病的病原,目前所使用的药物毒副作用大,且存在耐药现象。Homann等[29]构建了85个核苷酸的RNA序列文库,得到了3个家族的抗布氏锥虫适配体。其中,适配体2-16能折叠形成假结发夹结构并能够与血流阶段的布氏锥虫结合,亲和力达到6·0×10-5mol/L。这不仅对寄生虫病的治疗方法进行了探索,还为适配体用于活组织或其他复合物表面成分的鉴定及定位提供了依据。

3.2动物产品检验中的应用

适配体在动物产品检验方面的应用包括动物性食品的抗生素残留检测和微生物污染检测。近几年,适配体在动物性食品中抗生素残留检测方面的研究报道很多。Yeon等[30]用SELEX技术筛选到能特异性与土霉素类抗生素结合的核酸适配体,将其固定到黄金指状阵列(IDA)电极芯片上,制成了一种从动物组织中检测土霉素类药物的电化学传感器,该传感器特异性强灵敏度高,能将土霉素与其他结构相似抗生素区分开,最低检测浓度为1.0×10-6mol/L。Wochner等[31]筛选到一种与蒽环类药物特异性结合的适配体,建立了一种检测方法,对蒽环类抗生素柔红霉素和阿霉素的最低检出量为8.4×10-6g/L。Raghavendra等[32]首次将适配体应用到动物性食品的病原微生物检测上,他们筛选到一种与鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白特异性结合的适配体,将该适配体固定到磁性粒子上,用来捕获肉鸡胴体冲洗液和环境样品中的鼠伤寒沙门氏菌,然后用实时定量PCR进行检测,试验证明该方法有很高的检测灵敏度。

虽然有关适配体的研究发展得很快,但还存在着很多问题需要解决。随着问题的逐步解决与研究的深入,利用SELEX技术进行适配体的筛选,相信适配体在动物医学研究领域将会受到越来越多的重视。

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