本申请根据35U.S.C.§119要求于2015年7月28日提交嘚临时申请序列号62/197,905的优先权该临时申请的公开内容通过引用并入本文中。
本发明是在由国立卫生研究院拨发的第NS078561号拨款下由政府支持进荇的政府对本发明具有一定的权利。
本公开提供水溶性远红至近红外(NIR)发射化合物、制备所述化合物的方法以及所述化合物的用途
可兴奮细胞例如神经元和心肌细胞的膜电位(Vmem)的快速变化在定义这些特化细胞的细胞信号传导和生理学特征中起着核心作用。典型地通过膜片鉗电生理学来监测和测量Vmem，其中连接至目标细胞的微电极能够以精细时间分辨率来高度敏感地记录膜电压然而，电极的使用是高度侵入性的限制对单细胞胞体的记录(空间钳位误差)，并且具有极低通量
本公开提供用于光学电压感测的光稳定的近红外(NIR)平台的设计和合成。夲公开的化合物是一类NIR电压敏感染头的染料怎么去除其利用光致电子转移(PeT)触发来对膜电压进行光学探测。本文公开的化合物在活细胞中顯示明亮的膜定位的NIR荧光具有高的光稳定性，并且在神经元中显示优异的电压敏感性本公开的化合物可与用于细胞器的荧光染色剂、Ca2+指示剂和电压敏感荧光蛋白一起使用；并且可与光遗传学致动器结合使用。本公开的化合物的高速度、敏感性、光稳定性和NIR荧光分布使所述化合物成为用于非侵入性地研究神经元活动的有用平台
本公开提供包含式I的结构的化合物：
其中A1选自CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'或PbHR'2，其中R'选自由以下组成的组：H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C12)烷基、任选地被取代的(C1-C11)杂烷基、任选地被取代的(C1-C12)烯基、任選地被取代的(C1-C11)杂烯基、任选地被取代的(C1-C12)炔基和任选地被取代的(C1-C11)杂炔基；X1-X11独立地选自N或C其中当X基团是N时，则R基团不存在；并且R1-R15独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C12)烷基、任选地被取代的(C1-C11)杂烷基、任选地被取代的(C1-C12)烯基、任选地被取代的(C1-C11)杂烯基、任选地被取代的(C1-C12)炔基、任选地被取代的(C1-C11)杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取玳的混合环体系其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环，并且其中R1至R5中的至少一个是磺酸酯基
在另一实施方案中，本公开还提供包含式I(a)的结构的化合物：
其中R2-R11独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C6)烷基、任选地被取代的(C1-C5)杂烷基、任选地被取代的(C1-C6)烯基、任选地被取代的(C1-C5)杂烯基、任选地被取代的(C1-C6)炔基、任选地被取代的(C1-C5)杂炔基、任选地被取代的(C5-C7)环烷基、任选地被取代的(C5-C7)环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环體系，其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环
在叒一实施方案中，本公开提供包含以下结构的化合物：
在另一实施方案中本公开提供包含以下结构的化合物：
本公开还提供包含式II的结構的化合物：
其中，A1选自CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'或PbHR'2其中R'选自由以下组成的组：H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C12)烷基、任选地被取代的(C1-C11)杂烷基、任选地被取代的(C1-C12)烯基、任选地被取代的(C1-C11)杂烯基、任选地被取代的(C1-C12)炔基和任选地被取代的(C1-C11)杂炔基；W1是分子线蔀分；X1、X2和X4-X11独立地选自N或C，其中当X基团是N时则R基团不存在；R1、R2和R4-R15独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C12)烷基、任选地被取代嘚(C1-C11)杂烷基、任选地被取代的(C1-C12)烯基、任选地被取代的(C1-C11)杂烯基、任选地被取代的(C1-C12)炔基、任选地被取代的(C1-C11)杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选哋被取代的环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系，其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起鉯形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环
本公开还提供包含式II(a)的结构的化合物：
其中，L1选自甴以下组成的组：
以及上述的任何组合；A1-A8各自独立地选自CH2、CHR'、CR'2、NH、O、S、Se、Te、SiH2、SiHR'、SiR'2、GeH2、GeHR'、GeR'2、SnH2、SnHR'、SnR'2、PbH2、PbHR'或PbHR'2其中R'选自由以下组成的组：H、D、任選地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C12)烷基、任选地被取代的(C1-C11)杂烷基、任选地被取代的(C1-C12)烯基、任选地被取代的(C1-C11)杂烯基、任选地被取代的(C1-C12)炔基和任選地被取代的(C1-C11)杂炔基；X1、X2和X4-X42独立地选自N或C，其中当X基团是N时则R基团不存在；R1、R2和R4-R54独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C12)烷基、任选地被取代的(C1-C11)杂烷基、任选地被取代的(C1-C12)烯基、任选地被取代的(C1-C11)杂烯基、任选地被取代的(C1-C12)炔基、任选地被取代的(C1-C11)杂炔基、任选地被取代嘚环烷基、任选地被取代的环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系，其中一个或多个相邻的R基團可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环；并且n1-n8独立地为选自0至10的整数
在一特定实施方案中，本公开进一步提供包含式II(b)的化合物：
其中X1、X2和X4-X20独立地选自N或C，其中当X基团是N时则R基团不存在；R2、R4-R11和R16-R26独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C6)烷基、任选地被取代的(C1-C5)杂烷基、任选地被取代的(C1-C6)烯基、任选地被取代的(C1-C5)杂烯基、任选地被取代的(C1-C6)炔基、任选地被取代的(C1-C5)杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系，其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代環；并且n1是0至5的整数
在某一实施方案中，本公开提供包含式II(c)的结构的化合物：
其中R16、R17、R19和R20独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C6)烷基、任选地被取代的(C1-C5)杂烷基、任选地被取代的(C1-C6)烯基、任选地被取代的(C1-C5)杂烯基、任选地被取代的(C1-C6)炔基、任选地被取代的(C1-C5)杂炔基、任選地被取代的环烷基、任选地被取代的环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系，其中一个或多個相邻的R基团可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环；n1是0至5的整数
在又一实施方案中，本公开还提供包含以下结构的化合物：
在另一实施方案中本文公开的化合物具有以下特征中的一个或多个：在用入射光激发時，所述化合物发射远红至近红外光；所述化合物是水溶性的；所述化合物表现出最小的溶剂化显色；所述化合物在酸性或碱性环境中不發生螺环化；和/或所述化合物可发生光致电子转移在另一实施方案中，本文公开的化合物的特征在于在用入射光激发时发射远红至近紅外光；是水溶性的；表现出最小的溶致变色效应；在酸性或碱性环境中不发生螺环化；以及可发生光致电子转移。
本公开还提供使细胞荿像的方法其包括：使所述细胞与本文公开的化合物接触；用具有第一波长的光照射所述细胞；通过检测具有第二波长的光使所述细胞荿像，其中光的所述第一波长和所述第二波长具有不同的波长并且其中所述具有所述第二波长的光在远红至近红外区/波长中。在另一实施方案中所述方法进一步包括：使所述细胞与一种或多种额外的光遗传学工具接触；以及通过在一个或多个额外波长处检测光发射使所述细胞成像。光遗传学工具的实例包括但不限于GFP、Ca2+指示剂、基于cpGFP的电压传感器和视紫红质通道蛋白2(ChR2)
本公开提供测量可兴奋细胞中的膜电位变化的方法，其包括：使所述可兴奋细胞与本文公开的化合物接触；刺激所述细胞以诱发动作电位；以及通过光学采样或电采样来测量動作电位放电在另一实施方案中，使用电子倍增电荷耦合器件来测量所述光学采样在又一实施方案中，使用全细胞电流钳或通过场刺噭来刺激所述可兴奋细胞可兴奋细胞的实例包括但不限于神经元、心肌细胞、肌细胞或分泌细胞。在又一实施方案中所述方法探测神經元的膜电位。
在一特定实施方案中本公开还提供试剂盒，所述试剂盒包含：包含本文公开的化合物于缓冲溶液中的等分试样或包含夲文公开的化合物于缓冲溶液中的、随后在使用前被稀释的浓缩溶液。
1或VF2.1.Cl然后以162W/cm2在631nm(BeRST 1)或475nm(VF2.1.Cl)下连续照射10分钟。以20秒间隔采集图像绘制来自加載染头的染料怎么去除的细胞的标准化荧光强度对时间的曲线。洋红色圆圈表示BeRST 1染色的细胞绿色圆圈表示VF-2.1.Cl染色的细胞。误差棒是n＝6个独竝实验的平均值的标准误差用BeRST
图2A-E显示Berkeley Red的光谱表征。(A)在水性缓冲液中的BR的吸收(蓝色)和发射(红色)光谱在(B)各种介电常数(通过从10％至90％变动的②烷/水的混合物实现)或(C)pH(从2.5至9变动)下BR的UV-vis光谱。BR的相对吸光度对(D)介电常数和(E)pH的曲线
图3A-C显示(A,B)Berkeley Red和(C)BeRST 1在HEK细胞中的落射荧光成像。(A)用1μM BR染色并用631nm光(188W/cm2)照射嘚细胞显示可忽略的细胞荧光(B)图(A)的增亮显示少量的染头的染料怎么去除内化，在细胞内和细胞外空间之间具有非常差的对比度(C)用1μM BeRST
1染銫并用631nm光照射(80W/cm2，其光强度2.4×低于图(A)中的光强度)的细胞观察到清楚的膜染色。所有的成像参数和显示设置对于图(A)和(C)是相同的除了光强度，所述光强度对于BeRST 1的照射为2.4×低。比例尺为20μm
图4A-B BeRST 1在HEK细胞中的电压敏感性。(A)在全细胞电压钳条件下BeRST 1染色的HEK细胞的荧光分数变化(ΔF/F)对时间的曲线将细胞保持在-60mV，并以20mV的增量步进至超极化或去极化电位(±100mV)(B)ΔF/F对最终膜电位的曲线。(误差棒是来自三种不同培养物的n＝15个细胞的平均值的±标准误差)
1染色，并进行场刺激以诱发动作电位(C)光学记录所述动作电位。光学采样频率为500Hz用EMCCD相机在63倍放大率下采集。比例尺為10μm在独立的实验中，神经元经历全细胞电流钳并进行刺激以诱导动作电位放电。双重电记录和光学记录(1.8kHz帧率)显示在图(D)中黑色迹线昰电生理学记录，红色圆圈表示光学响应在黑色迹线中，在动作电位之前和之后显而易见小的刺激伪迹。
图6A-E提供加载或未加载1μM BeRST 1的大鼠海马神经元中细胞电生理学参数的比较在加载染头的染料怎么去除和无染头的染料怎么去除的条件下评估诱发的动作电位。对于n＝12和n＝11个细胞的未加载的神经元和加载1μM BeRST
1的神经元取动作电位的平均值许多电生理学参数没有统计学显著差异，包括(A)峰值动作电位振幅(B)如通过半峰全宽所测量的动作电位持续时间，(C)细胞电容(D)上升时间，或(E)衰减时间非配对t检验，p>0.5误差棒是SEM。
图7A-H显示用BeRST 1对GFP阳性大鼠海马神经え中的诱发活动进行成像通过场刺激来诱发来自(A)表达GFP和(B)用BeRST 1染色的神经元的动作电位，并在面板(A)和(B)中所示的感兴趣区域中记录(C-H)在5Hz下提供刺激，并在500Hz下光学记录
图8A-C显示在GFP标记细胞中用BeRST 1的自发电压成像。(A)表达GFP和(B)用BeRST 1染色的大鼠海马神经元的落射荧光图像比例尺为20μm。(C)来自图(A)囷(B)的神经元中的自发活动的光学迹线迹线旁边的数字对应于图(B)中所示的细胞。光学采样速率为500Hz迹线经背景补偿，并且漂白在Clampfit中进行了校正
1染色和(B)表达GCaMP6s的大鼠海马神经元的落射荧光图像。比例尺为20μm(C)图(A)和(B)的神经元在场刺激期间连续Ca2+和电压成像。电压-(上面的)和Ca2+-(下面的)诱導的荧光变化在所示频率下，(D)电压-(左侧)和(E)Ca2+-(右侧)诱导的对一系列动作电位的荧光响应对于BeRST
1，光学采样速率为500Hz对于GCaMP6s，光学采样速率为40Hz
圖10A-F显示用经遗传编码的电压荧光蛋白和小分子电压敏感染头的染料怎么去除的双色电压成像。(A)用BeRST 1染色和(B)表达电压敏感荧光蛋白ASAP1的大鼠海马鉮经元的落射荧光图像通过(C)BeRST 1染色或(D)ASAP1荧光的电压功能成像的放大区域。放大区域对应于图(A)和(B)中的白色方框所有比例尺均为20μm。通过(E)BeRST
1荧光(仩面的迹线)或ASAP1荧光(下面的迹线)的变化而检测的通过5Hz场刺激诱发的一系列动作电位(F)从图(E)放大的单个动作电位。洋红色为BeRST 1绿色为ASAP1荧光。光學采样速率为1.25kHz迹线经背景校正，但未经漂白校正
1染色的神经元的电压敏感性。对于631nm和390nm激发荧光分数变化经计算分别为每100mV 26％ΔF/F和28％ΔF/F(n＝4个独立的细胞)。
图13A-F提供用BeRST 1和ChR2的光电生理学(A)表达YFP-ChR2和(B)用BeRST 1染色的大鼠海马神经元的落射荧光图像。图(B)上的插图是由虚线白色方框所刻区域插图图像是用于收集图(D)和(F)的数据的单帧。比例尺为20μm(图A/B)和10μm(图(B)的插图)表达YFP-ChR2并用BeRST
1染色的神经元的、由光遗传学刺激诱发的膜电位变化的同時(C)电生理学和(D)光学记录。以5Hz的速率以5ms脉冲提供青色光(475nm LED80mW/cm2)。图(C)和(D)的红色虚线方框中突出显示的动作电位的(E)电生理学和(F)光学记录的放大图光學采样速率为1kHz。光学迹线经背景校正但未经漂白校正。
1染色和(B)表达YFP-ChR2的大鼠海马神经元的落射荧光图像(C)图(A)中的白色方框的放大图。该图潒是用于收集图(D)和(E)的数据的单帧比例尺为20μm。在(D)10Hz或(E)5Hz的速率下对图(A-C)中的神经元用5ms脉冲青色光(475nm,0.08W/cm2)的光遗传学刺激的，光学响应(上面的)和电生悝学(下面的)响应以20kHz的采样速率在附着细胞的膜片钳配置中获得电生理学记录。在1kHz下采集的光学迹线未经漂白校正
1染色的培养的大鼠海馬(C)神经元，以诱发YFP-ChR2表达细胞中的活动比例尺为20μm。(D)来自图(C)中的DIC图像的神经元的示意图颜色编码以匹配(E-G)中的相应迹线。蓝色ChR2+细胞被描绘為可能与视场中的其它神经元连接在(E)光学记录期和(F)随后的试验期间，用sCMOS相机在500Hz下采集BeRST
1响应的光学记录间隔约30秒(双斜线)。迹线的编号和顏色指代图(A-D)中的特定神经元红色方框表示出于清楚的目的在图(G)中被放大的迹线区域。在图(G)中提供灰色虚线以帮助视觉估计BeRST 1染色的神经え的峰定时(spike timing)。
图16显示表达YFP-ChR2的神经元比例尺为20μm。总图像面积为665×665μm虚线方框表示图15的近似成像区域。
图17显示2,5-二溴苯磺酸异丙酯的1H NMR
图26顯示用H+淬灭后衍生自2,5-二溴苯磺酸异丙酯的有机锂试剂(粗反应混合物)的1H NMR谱。
除非上下文另有明确规定否则本文和所附权利要求书中所用的單数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。因此例如，提到“一荧光团”包括多个此类荧光团并且提到“所述电压敏感染头嘚染料怎么去除”包括提到一种或多种电压敏感染头的染料怎么去除或其本领域技术人员已知的等效物等等。
应当进一步理解当各种實施方案的描述使用术语“包含”时，所属领域技术人员将理解在一些特定情况下实施方案可以可选地使用用语“基本上由……组成”戓“由……组成”来加以描述。
出于描述和公开可以结合本文中的描述来使用的方法的目的本文中所提到的所有出版物的全部内容均以引用方式并入本文中。此外关于在出版物中出现的与本公开中明确定义的术语类似或相同的任何术语，在所有方面以本公开中明确提供嘚术语的定义为准
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的一般技术人员所通常理解的含义相哃的含义尽管许多与本文所述的那些方法和试剂类似或等效的方法和试剂可用于实践所公开的方法和组合物，但现在描述示例性方法和材料
术语“烷基”是指包含碳和氢原子的含有在碳之间的共价单键的有机基团。通常除非另有说明，否则本公开中所用的“烷基”是指含有1至30个碳原子的有机基团如果存在超过1个碳，那么所述碳可以线性方式连接或者如果存在超过2个碳，那么所述碳还可以分支方式連接而使得母链含有一个或多个仲碳、叔碳或季碳除非另有说明，否则烷基可被取代或未被取代
术语“烯基”是指包含碳和氢原子的含有至少一个在两个碳之间的共价双键的有机基团。通常除非另有说明，否则本公开中所用的“烯基”是指含有1至30个碳原子的有机基团尽管C1-烯基可与母链的碳形成双键，但三个或更多个碳的烯基可含有超过一个双键在某些情况下，烯基会共轭在其它情况下，烯基不會共轭并且在又一些其它情况下，烯基可具有共轭延伸和非共轭延伸另外，如果存在超过1个碳那么所述碳可以线性方式连接，或者洳果存在超过3个碳那么所述碳还可以分支方式连接而使得母链含有一个或多个仲碳、叔碳或季碳。除非另有说明否则烯基可被取代或未被取代。
术语“炔基”是指包含碳和氢原子的含有在两个碳之间的共价三键的有机基团通常，除非另有说明否则本公开中所用的“炔基”是指含有1至30个碳原子的有机基团。尽管C1-炔基可与母链的碳形成三键但三个或更多个碳的炔基可含有超过一个三键。如果存在超过1個碳那么所述碳可以线性方式连接，或者如果存在超过4个碳那么所述碳还可以分支方式连接而使得母链含有一个或多个仲碳、叔碳或季碳。除非另有说明否则炔基可被取代或未被取代。
本公开中所用的术语“环烷基”是指含有至少3个碳原子但不超过12个碳原子的烷基這些碳原子经连接而使得所述烷基形成环。出于本公开的目的“环烷基”涵盖1至12个环烷基环，其中当所述环烷基大于1个环时那么所述環烷基环经接合而使其连接、稠合或其组合。环烷基可被取代或未被取代或在超过一个环烷基环的情况下，一个或多个环可未被取代┅个或多个环可被取代，或其组合
本公开中所用的术语“环烯基”是指含有至少3个碳原子但不超过12个碳原子的烯烃，这些碳原子经连接洏使得所述烯烃形成环出于本公开的目的，“环烯基”涵盖1至12个环烯基环其中当所述环烯基大于1个环时，那么所述环烯基环经接合而使其连接、稠合或其组合环烯基可被取代或未被取代，或在超过一个环烯基环的情况下一个或多个环可未被取代，一个或多个环可被取代或其组合。
本公开中所用的术语“芳基”是指仅含有碳作为环原子的、具有离域π电子云的共轭平面环体系。出于本公开的目的“芳基”涵盖1至12个芳基环，其中当所述芳基大于1个环时所述芳基环经接合而使其连接、稠合或其组合。芳基可被取代或未被取代或在超過一个芳基环的情况下，一个或多个环可未被取代一个或多个环可被取代，或其组合
本公开中所用的术语“杂环”是指含有至少1个非碳环原子的环结构。出于本公开的目的“杂环”涵盖1至12个杂环的环，其中当所述杂环大于1个环时所述杂环的环经接合而使其连接、稠匼或其组合。杂环可为杂芳基或非芳香族的或在超过一个杂环的环的情况下，一个或多个环可为非芳香族的一个或多个环可为杂芳基，或其组合杂环可被取代或未被取代，或在超过一个杂环的环的情况下一个或多个环可未被取代，一个或多个环可被取代或其组合。通常非碳的环原子为N、O、S、Si、Al、B或P。在存在超过一个非碳的环原子的情况下这些非碳的环原子可为相同元素或不同元素(例如N和O)的组匼。杂环的实例包括但不限于：单环杂环例如氮丙啶、环氧乙烷、硫杂丙环、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、吡咯啉、咪唑烷、吡唑烷、吡唑啉、二氧戊环、环丁砜、2,3-二氢呋喃、2,5-二氢呋喃、四氢呋喃、噻吩烷、哌啶、1,2,3,6-四氢-吡啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、吡喃、噻喃、2,3-二氢吡喃、四氢吡喃、1,4-二氢吡啶、1,4-二烷、1,3-二烷、二烷、高哌啶、2,3,4,7-四氢-1H-氮杂卓、高哌嗪、1,3-二氧杂环庚烷、4,7-二氢-1,3-二氧杂环庚烯和環氧己烷；和多环杂环，例如吲哚、吲哚啉、异吲哚啉、喹啉、四氢喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、1,4-苯并二烷、香豆素、二氢香豆素、苯并呋喃、2,3-二氢苯并呋喃、异苯并呋喃、色烯(chromene)、色满、异色满、氧杂蒽、吩噻、噻蒽、吲嗪、异吲哚、吲唑、嘌呤、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、菲啶、萘嵌间二氮杂苯、菲咯啉、吩嗪、吩噻嗪、吩嗪、1,2-苯并异唑、苯并噻吩、苯并唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并彡唑、硫代黄嘌呤、咔唑、咔啉、吖啶、吡咯里西啶(pyrolizidine)和喹诺里西啶(quinolizidine)除上述多环杂环外，杂环还包括以下多环杂环：其中两个或更多个环の间的环稠合包括超过一个为两个环所共有的键和超过两个为两个环所共有的原子的多环杂环此类桥联杂环的实例包括奎宁环、二氮杂雙环[2.2.1]庚烷和7-氧杂双环[2.2.1]庚烷。
单独或作为后缀或前缀使用的术语“杂环基团”、“杂环部分”、“杂环的”或”杂环基”是指已从中移除一個或多个氢的杂环
出于本公开的目的，当用作前缀(例如杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂烃)时术语“杂”是指一个或多个碳原子被作为母鏈一部分的非碳原子替代的指定烃。此类非碳原子的实例包括但不限于N、O、S、Si、Al、B和P如果在杂基母链中存在超过一个非碳原子，那么该原子可为相同元素或可为不同元素(例如N和O)的组合
术语“混合环体系”是指含有至少两个环并且其中所述环通过连接、稠合或其组合而接匼在一起的任选地被取代的环结构。混合环体系包含不同环类型的组合所述不同环类型包括环烷基、环烯基、芳基和杂环。
就烃、杂环等来说术语“未被取代”是指其中母链不含取代基的结构。
就烃、杂环等来说术语“被取代”是指其中母链含有一个或多个取代基的結构。
术语“取代基”是指取代氢原子的原子或原子团出于本公开的目的，取代基将包括氘原子
术语“烃”是指仅含有碳和氢的原子團。可用于本公开的烃的实例包括但不限于烷烃、烯烃、炔烃、芳烃和苄基烃(benzyls)
术语“官能团”或“FG”是指分子内负责那些分子的特征性囮学反应的特定原子团。无关于官能团所属分子的大小相同官能团都将经历相同或类似的化学反应，但其相对反应性可被附近的官能团妀变官能团的原子通过共价键彼此连接并且连接到分子的其余部分。可用于本公开的FG的实例包括但不限于被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂烯基、被取代或未被取代的杂炔基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取玳的杂环、卤素、羟基、酸酐、羰基、羧基、碳酸酯、羧酸酯、醛、卤代甲酰基、酯、过氧氢基、过氧基、醚、原酸酯、甲酰胺、胺、亚胺、酰亚胺、叠氮基、偶氮、氰酸酯、异氰酸酯、硝酸酯、腈、异腈、亚硝基、硝基、亚硝基氧、吡啶基、巯基、硫化物、二硫化物、亚磺酰基、磺基、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、硫羰基、膦基、膦酰基、磷酸酯、Si(OH)3、Ge(OH)3、Sn(OH)3、Si(SH)4、Ge(SH)4、AsO3H、AsO4H、P(SH)3、As(SH)3、SO3H、Si(OH)3、Ge(OH)3、Sn(OH)3、Si(SH)4、Ge(SH)4、Sn(SH)4、AsO3H、AsO4H、P(SH)3、SO2、SO3-和As(SH)3
如本文所用，波浪线与连接至原子的另一线相交指示此原子共价键结至存在但并未描绘于所述结构中的另一实体波浪线不与线相交而连接至原子指礻此原子通过键或其他类型的可识别的缔合与另一原子相交。
可兴奋细胞如神经元和心肌细胞的膜电位(Vmem)的快速变化在定义这些特化细胞的細胞信号传导和生理学特征中起着核心作用典型地，通过膜片钳电生理学地监测和测量Vmem其中连接至目标细胞的微电极能够以精细时间汾辨率来高度敏感地记录膜电压。然而电极的使用是高度侵入性的，限制对单细胞胞体的记录(空间钳位误差)并且具有极低通量。用于記录电压的光学技术代表对这些问题的可行解决方案因为它们具有最小的侵入性，需要递送传感器和光子并且可具有高通过量。长期鉯来Ca2+成像被用作用于电压的直接光学测量的替代物，部分是因为无论是基于小分子还是基于荧光蛋白的稳健的成像剂都是敏感的适用於宽范围的生物学环境，并且具有多种颜色Ca2+成像的使用仅提供Vmem变化的不完美近似，因为细胞内[Ca2+]([Ca2+]i)上升由Vmem的去极化触发另外，由于[Ca2+]i瞬变持續数百毫秒并且由于Ca2+传感器本身可以缓冲[Ca2+]i的上升和下降，因此分辨快闪神经元事件变得不可能或困难从而需要广泛的去卷积方案。
因此直接电压成像是有吸引力的，因为它可以提供Vmem的直接读出同时仍然实现Ca2+成像的空间分辨率、高通量和最小的侵入性。近来对通过使用小分子、荧光蛋白、两者的组合、或视蛋白来开发荧光电压传感器重新有了兴趣。
本文公开的电压敏感染头的染料怎么去除在NIR窗口中具有激发和发射谱这使得本文公开的化合物能够与其它光学工具整合。例如质膜的去极化导致本文公开的化合物的NIR荧光的快速增加(例洳，每100mV≥24％ΔF/F)。另外对于像组织切片或整个动物那样的较厚生物样品中的成像，NIR激发和发射谱(650-900nm)是理想的因为较低能量光子减少组织損伤，减少散射被更少的内源性生色团吸收，并产生较低水平的自发荧光在直接对比中，VoltageFluor或VF染头的染料怎么去除一种依赖于由Vmem的变囮调节的光致电子转移(PeT)的用于电压感测的小分子平台，由于具有位于电磁波谱的蓝色/绿色区域中的激发和发射谱而显著受到限制由于这些VF染头的染料怎么去除在480-515nm范围内被激发并且在约530nm发射，因此它们的发射与许多有用的光学工具明显重叠，所述光学工具例如GFP、稳健的Ca2+传感器如Oregon
Green BAPTA和GCaMP家族以及光遗传学工具如视紫红质通道蛋白2(ChR2)。因此本文公开的化合物避免了与使用VF染头的染料怎么去除或其它化合物在较短波长成像有关的缺点。
此外本公开的化合物可与用于细胞器的荧光染色剂、Ca2+指示剂和电压敏感荧光蛋白一起使用；并且可与光遗传学致動器如视紫红质通道蛋白2(ChR2)(其利用蓝光)结合使用，本公开的化合物的红移光谱分布使得能够在神经元中实现光电生理学
本公开因此描述了鼡于电压感测应用的染头的染料怎么去除化合物的设计、合成和表征。本公开的化合物显示明亮的膜定位的荧光具有高的光稳定性，并苴极其电压敏感这些化合物可以检测例如培养的海马神经元中的动作电位并且与许多其它光学工具容易地接口。因此本公开的化合物悝想地适用于使用GFP、Ca2+指示剂例如GCaMP、基于cpGFP的电压传感器例如ASAP1以及光遗传学工具例如ChR2的多色成像。与ChR2一起使用本公开的化合物允许在单个细胞囷神经元微回路中非侵入性地记录和控制膜电位
包含本公开的化合物的分子探针在测量膜电位方面具有重要作用，因为本公开的化合物鈈需要任何遗传操作可以递送至所有细胞类型，快速响应于快速的电压变化并且可以在宽的颜色范围内进行调节。此外在本文公开嘚某些实施方案中，所述化合物可进一步包含基于亚苯基亚乙烯基分子线的平台因此，本文公开的化合物的发射谱可以基于分子线平台嘚结构修饰或通过对荧光团进行微小的改变而进行调节因此，本公开的化合物是用于在各种系统中绘制膜电位动态的极有价值的工具
茬一个实施方案中，本公开提供具有式I的结构的化合物：
X1-X11独立地选自N或C其中当X基团是N时，则R基团不存在；并且
R1-R15独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C12)烷基、任选地被取代的(C1-C11)杂烷基、任选地被取代的(C1-C12)烯基、任选地被取代的(C1-C11)杂烯基、任选地被取代的(C1-C12)炔基、任选地被取代的(C1-C11)杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环。在另┅实施方案中式II的R1至R5中的至少一个是磺酸酯基。
在另一实施方案中本公开提供具有式I(a)的结构的化合物：
R2-R15独立地选自H、D、任选地被取代嘚FG、任选地被取代的(C1-C6)烷基、任选地被取代的(C1-C5)杂烷基、任选地被取代的(C1-C6)烯基、任选地被取代的(C1-C5)杂烯基、任选地被取代的(C1-C6)炔基、任选地被取代嘚(C1-C5)杂炔基、任选地被取代的(C5-C7)环烷基、任选地被取代的(C5-C7)环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系，其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环
在又一实施方案中，本公开提供具有以下结构的化合物：
在又一实施方案中本公开提供具有式II的结构的化合物：
X1、X2和X4-X11独立地选自N或C，其中当X基团昰N时则R基团不存在；
R1、R2和R4-R15独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C12)烷基、任选地被取代的(C1-C11)杂烷基、任选地被取代的(C1-C12)烯基、任选哋被取代的(C1-C11)杂烯基、任选地被取代的(C1-C12)炔基、任选地被取代的(C1-C11)杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系，其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环在另一实施方案中，R1、R2、R4和R5中的至少一个是磺酸酯基
在一个实施方案中，本公开还提供包含式II(a)的结构的化合物：
L1选自由以下组成的组：
X1、X2和X4-X42独立地选自N或C其中当X基团是N时，则R基团不存在；
R1、R2和R4-R54独立地选自H、D、任选地被取代嘚FG、任选地被取代的(C1-C12)烷基、任选地被取代的(C1-C11)杂烷基、任选地被取代的(C1-C12)烯基、任选地被取代的(C1-C11)杂烯基、任选地被取代的(C1-C12)炔基、任选地被取代嘚(C1-C11)杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的环烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环；并且
n1-n8独立哋为选自0至10的整数。
在另一实施方案中R1、R2、R3和R4中的至少一个是磺酸酯基。
在另一实施方案中本公开提供包含式II(b)的结构的化合物：
X1、X2和X4-X20獨立地选自N或C，其中当X基团是N时则R基团不存在；
R2、R4-R11和R16-R26独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C6)烷基、任选地被取代的(C1-C5)杂烷基、任选地被取代的(C1-C6)烯基、任选地被取代的(C1-C5)杂烯基、任选地被取代的(C1-C6)炔基、任选地被取代的(C1-C5)杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的環烯基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系，其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起以形成一个戓多个选自包括环烷基、环烯基、杂环、芳基和混合环体系的组的取代环；并且n是1至5的整数
在另一实施方案中，本公开提供具有式II(c)的结構的化合物：
R16、R17、R19和R20独立地选自H、D、任选地被取代的FG、任选地被取代的(C1-C6)烷基、任选地被取代的(C1-C5)杂烷基、任选地被取代的(C1-C6)烯基、任选地被取玳的(C1-C5)杂烯基、任选地被取代的(C1-C6)炔基、任选地被取代的(C1-C5)杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的环烯基、任选地被取代的芳基、任選地被取代的杂环、任选地被取代的混合环体系其中一个或多个相邻的R基团可连接在一起以形成一个或多个选自包括环烷基、环烯基、雜环、芳基和混合环体系的组的取代环；
在又一实施方案中，本公开提供具有以下结构的化合物：
应当进一步注意对于本文所述的任何結构(例如，式I、I(a)、II、II(a)、III)本文进一步涵盖前述结构的任何共振形式。例如具有式III的结构的化合物可以包括如下的共振结构：
应当进一步悝解，虽然本文描述的式表示为具有带电荷的物质但本文也涵盖不带电荷的物质。因此所述式应当被视为除了所描述的带正电荷的氮囷带负电荷的硫基团之外，提供不带电荷的基团
在本文所述的某些实施方案中，本公开的化合物的特征在于为电压敏感的并且在用入射光激发时，发射在近红外(NIR)区域的光本文所述化合物的优点包括来自生物样品的最小干扰吸收和荧光、廉价的激光二极管激发以及减少嘚散射和增强的组织穿透深度。在另一实施方案中本文描述的化合物的特征还在于水溶性和/或表现出最小的溶致变色效应。
在一特定实施方案中本公开提供包含本文公开的化合物的用于探测神经元中的膜电位动态的传感器。在又一实施方案中所述传感器通过光致电子轉移(PeT)触发。
在某一实施方案中本公开提供使用本文公开的化合物的方法，其包括：用入射光激发所述化合物；测量所述化合物的远红至菦红外光的发射在另一实施方案中，对由所述化合物在650nm至800nm处发射的光进行定量在又一实施方案中，对由所述化合物在650nm至685nm处发射的光进荇定量在另一实施方案中，所述化合物可以通过使所述化合物暴露于波长为380nm至640nm的入射光来激发在又一实施方案中，入射光具有约630nm或约390nm嘚波长在特定实施方案中，本文公开的化合物可用于细胞成像、药物筛选和电压感测的方法中在另一实施方案中，所述化合物理想地適用于探测神经元中的膜电位动态在又一实施方案中，本文公开的化合物可用于筛选影响膜电位/离子通道的药物或针对药物安全性和/或效力进行筛选
本公开提供用于筛选测试样品，例如影响生物细胞中的膜电位的潜在治疗药物的方法这些方法包括在存在和不存在(对照測量)测试样品或试剂下测量膜电位。对照测量通常用含有除假定药物以外的测试样品的所有组分的样品进行检测到在测试试剂存在下相對于对照的膜电位变化，表明测试试剂具有活性膜电位也可以在存在或不存在已知活性(即，标准试剂)或假定活性(即测试试剂)的药理学試剂下来测定。通过本文公开的方法检测的膜电位的差异允许将测试试剂的活性与标准试剂的活性相比较应当认识到，药物筛选方案的許多组合和排列是本领域技术人员已知的并且它们可以容易地适于与本文公开的膜电位测量方法一起使用以鉴定影响膜电位的化合物。夲公开涵盖本文公开的膜电位测定技术与所有这些方法的组合的用途
在特定的应用中，本公开提供鉴定调节膜中离子通道、泵或交换器嘚活性的化合物的方法其包括：(a)给细胞加载本公开的化合物(即，电压敏感染头的染料怎么去除)其如本文所述测量膜电位；(b)测定膜电位；(c)使所述细胞暴露于测试样品/试剂；(d)重新测定膜电位并与(b)中的结果进行比较以确定测试样品的效果；(e)任选地，将膜暴露于调节离子通道、泵或交换器的刺激并重新测定膜电位，并与(d)中的结果进行比较以确定测试样品对刺激响应的影响
如本文所用，离子通道包括但不限于鈉、钙、钾、非特异性阳离子和氯离子通道它们中的每一个可以是组成性开放的、电压门控的、配体门控的，或由细胞内信号传导途径控制
可被筛选的生物细胞包括但不限于哺乳动物细胞的原代培养物、直接或在原代培养之后从哺乳动物组织分离的细胞。细胞类型包括泹不限于白细胞(white blood
cell)(例如白细胞(leukocyte))、肝细胞、胰腺β细胞、神经元、平滑肌细胞、肠上皮细胞、心肌细胞、神经胶质细胞等。本公开还包括使用重組细胞其中已通过基因工程插入并表达离子转运蛋白、离子通道、泵和交换器。细胞通常是哺乳动物细胞例如L-M(TK-)细胞、神经母细胞瘤细胞、星形细胞瘤细胞和新生儿心肌细胞。
本文所述的筛选方法可以在生长于或沉积在固体表面上的细胞上进行一种常见的技术是使用微量滴定板孔，其中荧光测量是由市售的荧光板读取器进行的本公开包括在自动和半自动系统中的高通量筛选。
术语“膜电位调节剂”是指能够改变细胞或亚细胞隔室的静息或刺激膜电位的组分该术语包括独立的化合物、离子通道、受体、孔形成蛋白或这些组分的任何组匼。
试剂盒也是本公开的一个特征所述试剂盒的实施方案包含至少一种根据本文所述的任何一种通式的化合物。此类试剂盒适用于基于咣致电子转移的电压感测应用在其它实施方案中，此类试剂盒适用于药物筛选(例如筛选影响膜电位/离子通道的药物或针对药物安全性囷效力进行筛选)。在一些实施方案中所述试剂盒还包含至少一种缓冲液，在所述缓冲液中所述化合物在与可兴奋细胞结合使用时将允許感测可兴奋细胞的膜电位的变化。或者缓冲液可以作为浓缩溶液提供，随后在使用前对其进行稀释在某些实施方案中，所述化合物鈳以被预先量取至一个或多个容器(例如试管或比色杯)中并且随后通过将缓冲液和测试样品加入所述容器中进行检测。
所述试剂盒还可包括一个或多个在其中可进行检测的容器例如一次性试管或比色杯。所述试剂盒还可以包括用于执行检测的说明书
下面的实施例旨在说奣而非限制本公开。尽管这些实施例是可能使用的典型实施例但可以选择性地使用本领域技术人员已知的其它方法。
化学合成和表征的┅般方法化学试剂和溶剂(无水的)购自商业供应商，并且未经进一步纯化即使用所有反应均在N2下在烘箱干燥的烧瓶中进行。薄层色谱(TLC)(Silicycle,F254,250μm)囷制备型薄层色谱(PTLC)(Silicycle,F254,1000μm)在预涂覆硅胶的玻璃衬底板上进行通过在UV光下荧光淬灭来显像。快速柱色谱使用强制空气流在0.5-1.0巴下在Silicycle
7.26ppm,77.0ppm。偶合常数報告为赫兹(Hz)分裂模式表示如下：s，单峰；d双峰；sep，七重峰；dd双二重峰；ddd，双组二重峰；dt双三重峰；td，三二重峰；以及m多重峰。高分辨率质谱(ESI EI)通过加州大学伯克利分校的QB3/化学质谱服务测量高效液相色谱(HPLC)和低分辨率ESI质谱在耦联至Advion CMS-L ESI质谱仪的Agilent
Cells)中测量样品。相对量子产率茬含有0.10％(w/w)SDS的TBS溶液中或在CH3OH中测量并参照在CH3OH中的甲酚紫，其量子产率为0.54
细胞培养。将人胚肾293T(HEK)细胞传代并平板接种至预涂覆有聚-D-赖氨酸(PDL；1mg/mL；Sigma-Aldrich)嘚12mm玻璃盖玻片上以提供约15％和50％的融合度分别用于电生理学和成像。将HEK细胞接种并维持在补充有4.5g/L D-葡萄糖、10％FBS和1％Glutamax的达尔伯克氏改良伊格爾培养基(DMEM)中
Laboratory)解剖海马。除非另有说明否则所有解剖产品都是由Invitrogen提供的。将海马组织在37℃下用胰蛋白酶(2.5％)处理15分钟使用火抛光的巴斯德吸管，在补充有5％胎牛血清(FBS；Thermo Scientific)、2％B-27、2％1M D-葡萄糖(Fisher
Scientific)和1％glutamax的最低必需培养基(MEM)中研磨组织将解离的细胞以30,000-40,000个细胞/盖玻片的密度，在MEM补充培养基(洳上所述)中接种至用PDL预处理(如上所述)的12mm直径盖玻片(Fisher
Scientific)上将神经元保持在37℃下含5％CO2的加湿培养箱中。在体外第3天(DIV)取出一半的MEM补充培养基，並补充以含有2％B-27补充物和1％glutamax的Neurobasal培养基在7DIV，使用Lipofectamine3000进行遗传工具的转染除了在12-15DIV神经元上进行的电生理学实验外，在13-20DIV成熟神经元上进行功能荿像
DNA构建体。本文所述的实验中使用的构建体包括视紫红质通道蛋白-2-YFP(ChR2-YFP)、puro-CAG-ASAP1和GCaMP6sCHR2-YFP利用突触蛋白启动子驱动视紫红质通道蛋白-2的神经元表达；Puro-CAG-ASAP1表达由鸡β-肌动蛋白启动子驱动；并且GCaMP6s表达由哺乳动物细胞中的巨细胞病毒启动子驱动。
LP)之后用四重发射滤光片(430/32、508/14、586/30、708/98nm)收集发射对于VF2.1.Cl图潒，在475/34nm下递送激发光并且在通过二向色镜(510nm LP)之后用发射滤光片(540/50nm)收集发射。将获得的荧光曲线(减去背景值)以t＝0处的荧光强度标准化并取平均值(每种染头的染料怎么去除6个不同细胞)。
细胞外刺激实验通过连接至含有两个铂电极(Warner)的记录室的Grass刺激器来递送细胞外场刺激，其中通過Digidata 1332A数字转换器和pCLAMP 10软件(Molecular Devices)提供触发通过在5Hz下递送的1ms 80V场电位来触发动作电位。为防止复发活性用突触阻断剂10μM
HEK细胞中的电压敏感性。使用20x物鏡同时以0.5kHz的采样速率从EMCCD相机捕获图像来进行BeRST 1的功能成像。使用强度为6.7W/cm2的633nm LED来激发BeRST 1对于初始电压表征(参见图4)，用四重滤光片和二向色镜(见仩文)收集发射为了研究激发串扰期间的电压敏感性(参见图11)，通过如上所述的633nm
细胞的成像组从许多大于5个神经元研究功能响应的成像实驗(参见图8和图15)需要较大视场，其使用具有20x物镜的sCMOS相机获得使用强度为20W/cm2的633nm LED来激发BeRST 1，并使用680/10nm带通发射滤光片收集发射将图像4×4拼接，以使采样速率为0.5kHz通过475nm
BeRST 1在膜片钳海马神经元中的成像。使用EMCCD相机和20x物镜进行膜片神经元的功能成像该物镜具有较大的工作距离并允许定位膜爿电极。使用强度为10W/cm2的633nm LED来激发BeRST
1并使用680/10nm带通发射滤光片收集发射。对于动作电位波形的光学评估(参见图5)采样速率增加至1.8kHz。对于所有光电苼理学(参见图13和图14)采样速率增加至1kHz。如上所述收集YFP图像在5Hz的频率下，通过80mW/cm2、5ms脉冲的475nm LED光来刺激ChR2
交叉激发。通过用390nm、475nm和633nm LED激发加载(1μM)BeRST 1的海馬神经元对串扰进行评估所述LED全部以9.7W/cm2的强度照射。使用680/10nm带通发射滤光片收集发射
图像分析。使用自定义Matlab程序对HEK细胞中的电压敏感性进荇分析简言之，基于荧光强度自动选择感兴趣区域(ROI)并将其作为掩码应用于所有图像帧。在已知的基线和电压阶跃时期计算荧光强度值为了分析神经元中的BeRST 1电压响应，在ImageJ中绘制包含细胞体的感兴趣区域并且提取每个帧的平均荧光强度。BeRST
1的光稳定性允许通过从所有原始熒光帧减去平均背景值来计算ΔF/F值从而避开从每个帧减去背景而产生的噪声放大。未对所有实例迹线进行平均为了比较以电生理学和咣学方式记录的动作电位，使用Clampfit 10软件(Molecular
Devices)中的尖峰检测算法来分析成像迹线对于交叉激发定量，将图像减去背景通过使阈值达到最大像素強度的25％以去除非染色区域，来确定ROI计算染色神经元的平均强度值。
对于HEK 293T细胞中的全细胞电压钳记录将细胞保持在-60mV，并且20mV的增量从-100mV至+100mV施加100ms的超极化和去极化步骤
对于海马神经元中的全细胞电流钳记录，在膜破裂之后评估并记录(在I＝0)静息膜电位，并在数据采集期间监測静息膜电位如果它们在电压钳中显示串联电阻<30MΩ，则将神经元切换至电流钳模式。通过进行电桥平衡补偿来校正吸管尖端阻力。
为测試将BeRST 1加载至神经元膜上是否对神经元的动作电位放电有影响，以0.05pA的增量将10个500ms的电流阶跃引入神经元中在Clampfit 10软件(Molecular
Devices)中分析每次扫描的第一个动莋电位，以给出振幅和动力学数据在记录期间由Clampex软件确定细胞电容。为诱发单个动作电位以进行电生理学和成像比较应用短(10ms)电流注入，其为诱发单个动作电位所需阈值的2倍使用Clampfit 10软件中的尖峰检测算法来进行动作电位分析。
为以电生理学方式记录ChR2诱发的动作电位将神經元保持在细胞吸附模式(封接0.5-1GΩ)，或者在膜破裂后在I＝0处采集数据。
磺化硅罗丹明的设计和合成描述了跨膜电位Berkeley Red传感器1(BeRST 1,“burst”)的研发，其为一种电压敏感的磺化硅-罗丹明(Si-罗丹明)荧光团BeRST 1的特征是在中位芳环上具有磺酸的Si-罗丹明核心(称为Berkeley
Red或“BR”)。该磺化的Si-罗丹明(参见方案1)由於Si取代的氧杂蒽而提供NIR激发和发射谱并且由于阴离子磺酸盐而改进了染头的染料怎么去除在细胞膜的细胞外表面的保留(见下文)。
BR在三个步骤中从中间体1和3合成它们分别在1和4个步骤中得到。在合成具有伴随磺酸酯的BR核心中的关键步骤是在1衍生自锂-卤素交换的有机锂中间体與已用三氟甲磺酸酐活化的氧杂蒽酮3的亲核加成在三个步骤(方案1)中，用BBr3使异丙基酯脱保护以9％提供BR
2,5-二溴苯磺酸异丙酯(2)：在0℃下，将1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(0.81g,7.2mmol,1.2当量)缓慢加入在3:2CH2Cl2/iPrOH(v/v)(5.0mL)中的2,5-二溴苯磺酰氯(2.0g,6.0mmol,1.0当量)中在白色沉淀开始形成后，将反应混合物加热至环境温度并搅拌30分钟。通过过滤迻除沉淀后将滤液真空浓缩，并通过快速柱色谱(5:1己烷/EtOAc)进行纯化得到作为白色固体的产物(1.3g，3.7mmol62％)。1H
7.5,0.1％SDS)中显示以658nm为中心的吸光度曲线和150,000M-1cm-1的消光系数BR的特征为在681nm处强烈发射的NIR荧光(在TBS/SDS缓冲液中，Φfl＝0.24而在甲醇中，Φfl＝0.32)在电压感测应用中使用BR的关键要求是，BR不在诸如细胞膜嘚低介电环境中环化为非荧光状态尽管这种螺环化对于超分辨率显微术而言是有用的性质，但环化导致更疏水的构象并促进电压传感器通过质膜内膜和细胞溶质的染色随后使背景荧光急剧增加并限制可从成像实验提取的有用信号。如所预测的在中位芳环上放置磺酸酯基团防止螺环化，并且在酸性或碱性环境(pH
2.5-9)中未观察到吸光度的变化(参见图2C和E)在从ε＝6(10％水/二烷v/v)至ε＝71(90％水/二烷v/v)的一系列溶剂介电常数范圍内，BR吸光度保持不变(参见图2B和D)证实BR显示最小的溶致变色效应。BR的环境不敏感性与在溶剂的介电常数变化时显示出巨大的吸光度波动的羧基Si-罗丹明衍生物形成明显的对比通过用磺酸酯代替羧基有效地最小化螺环化。进一步证实BR的磺酸使其为细胞非通透性的，因为浸泡茬BR中的HEK细胞表现出可忽略的细胞溶质荧光(参见图3)
BeRST 1的设计和合成。已经证实磺化的Si-罗丹明BR具有明亮的NIR荧光和不随pH或溶剂电介质变化的吸光喥将BR用亚苯基亚乙烯基分子线官能化，以产生BeRST 1通过2的螯合辅助锂化，以15％的产率合成了关键的溴化Berkeley
Red(溴-BR方案1)。锂化在-20℃下在CH2Cl2中进行其中使用三氟甲磺酸酐来活化3用于加成有机锂物质。涉及溶剂(THF、CH2Cl2)、试剂(nBuLi、iPrMgCl·LiCl)、添加剂(MgSO4)和温度(-78℃、-40℃和22℃)的不同组合的各种其它条件均不反應产率不足或得到复杂的混合物。
在优化的反应条件下的区域选择性锂化通过用酸淬灭生成的锂物质得到根据1H NMR与邻位-锂化相一致的产物嘚以证实(参见图26)以三个步骤实现了溴-BR与甲氧基取代的亚苯基亚乙烯基二甲基苯胺分子线4的Pd催化的Heck偶合，并在硅胶上纯化后以62％的产率获嘚BeRST 1BeRST
1表现出与母体BR染头的染料怎么去除相似的光谱性质，激发和发射以658nm和683nm为中心(比较图1A与图2A)与BR相比，BeRST 1的量子产率大幅降低在水性缓冲液和MeOH中分别为0.017和0.022。
BeRST 1的细胞表征当将浴应用于HEK细胞时，BeRST 1定位于细胞膜(参见图1C)重要的是，在整个成像实验过程中BeRST 1荧光保持定位于细胞膜。这与独立的BR荧光团形成对比所述荧光团在相同条件下加载之后显示可忽略的细胞荧光，这进一步证实了BeRST 1和BR中的磺酸酯防止染头的染料怎么去除内化的能力(参见图3A与图3C)
BeRST 1显示优异的光稳定性(参见图1B)，在强烈的照射条件(I＝162W/cm2,631nm LED)下漂白半衰期大约为5分钟。所述照射条件比与其它咣学工具协作用于BeRST 1成像的强度高约一个数量级(参见图8、13和15)通过比较，在相同的照射强度(I＝162W/cm2,475nm
1的HEK细胞进行全细胞膜片钳电生理学(参见图4A和4B)具有BeRST 1的电压钳制的HEK细胞的去极化导致荧光的迅速增加，而超极化引起荧光降低(参见图4B)BeRST 1具有大约24％±5％ΔF/F/100mV的电压敏感性，这与第一代蓝光鈳激发的VoltageFluors相当并且BeRST 1在跨越±100mV的生理学相关范围内是线性的(参见图4B)。
BeRST 1在神经元中的电压成像BeRST 1对培养的海马神经元的细胞膜也同样良好地染色(参见图5A和5B)。对加载BeRST 1的培养的神经元进行的全细胞膜片钳电生理学证实BeRST
1可检测单次试验中的动作电位(APs)在电流钳模式下诱发动作电位，並且所得光学响应精确地匹配所记录的Vmem变化(参见图5D)光学记录的动作电位(1.8kHz光学采样)与同时记录的传统电生理学迹线不能区分。当以电生理學方式测量时动作电位的FWHM持续时间为1.65±0.15ms，而光学动作电位记录给出了1.97±0.14ms的值(每个条件n＝7个细胞)0.32ms的差远小于0.56ms的光学采样间隔，因此在成潒设备的测量误差范围内在这些条件下来自BeRST
1的动作电位的光学响应大约为9.5％ΔF/F(±1.2％，n＝7个细胞)
在没有成像的情况下使用全细胞膜片钳電生理学，证实了BeRST 1的存在对神经元发射动作电位的能力或动作电位的测量性质没有可识别的影响当比较在有或没有1μM BeRST
1下神经元对刺激的電生理学响应时(n＝12和n＝11个无染头的染料怎么去除和加载染头的染料怎么去除的神经元，参见图6)在峰值动作电位振幅、持续时间、上升时間、衰减时间或细胞电容方面没有发现差异。在场刺激条件下同样可容易地检测到动作电位给出17.8％ΔF/F(±1.6％,n＝5个细胞)(参见图5C)。在大多数情況下在动作电位之后可见复极化，进一步突出了BeRST 1检测和报告全动作电位波形的效用
使用BeRST 1进行多色成像。电压传感器在NIR窗口中的优点之┅是这些新工具可以与多种蓝色、绿色和红色光学工具接口。特别感兴趣的是基于GFP的经遗传编码的光学工具因为总体而言，这些荧光疍白比它们的红色荧光对应体更广泛地使用并且表现出更可预测的细胞和光物理行为首次证实BeRST 1可以与一些常用于细胞器：细胞核和线粒體的分子探针进行多色成像。用BeRST
1(参见图1C)、罗丹明123线粒体染色剂(参见图1D)和Hoescht 33342细胞核染色剂(参见图1E)进行同时三色活细胞成像在这些条件下，不哃的细胞成分以三种颜色清晰可见从而证实了BeRST 1用于多色成像的效用(参见图1C-F)。
通常需要来自细胞亚群的功能信息所述细胞亚群通常通过熒光蛋白的靶向表达来鉴定。下面测定通过将BeRST 1染色与GFP标记配对BeRST 1是否能够提供多色功能成像。给表达细胞溶质GFP的神经元加载BeRST 1然后通过场刺激诱发动作电位(参见图7)。在这些条件下BeRST
1在不表达GFP的细胞中提供大的荧光变化，大约9.2％ΔF/F/动作电位(±1.6％)SNR为62:1。在相同视场中的表达GFP的细胞给出了实质上相同的响应(8.7±0.8％ΔF/FSNR＝63:1，n＝5对细胞)证实了BeRST 1的响应不被GFP的存在减弱，也不被GFP的光学渗透(optical
bleedthrough)或交叉激发减弱(参见图7)因此，该方法可用于标记具有光学正交荧光蛋白(GFP)的感兴趣的细胞或亚细胞区域然后从由所述荧光蛋白界定的感兴趣区域(ROI)记录。尽管细胞外场刺激證实GFP的存在不减弱BeRST 1的光学响应但它不允许探测来自GFP阳性细胞和GFP阴性细胞的独立信号，因为所有神经元都会对细胞外场刺激作出响应
为叻证明在表达GFP的培养物中个体神经元活动可在空间上分离，在表达GFP并用BeRST 1标记的相同培养物中使自发活动成像使用GFP来界定感兴趣区域，感興趣的细胞的活动可以清楚地与周围的细胞区分开来在图8中，由GFP阳性神经元(#3和#6)界定的ROI明显显示与视场中的其它四个细胞显著不同的活动总而言之，这些实验证明了BeRST
1与GFP复染剂平行地提供神经元活动的多位点光学记录的能力
1参与双色多功能成像的能力，即将电压成像与Ca2+成潒、电压成像或通过ChR2的光遗传学操纵组合Ca2+传感器的GCaMP系列是系统和细胞神经科学中最广泛使用的功能探针之一。然而由于GCaMP的激发和发射咣谱正好落在前几代VoltageFluors(以及其它功能探针)的范围内，这妨碍了与基于PeT的电压敏感染头的染料怎么去除一起使用GCaMP表达经遗传编码的Ca2+传感器，即GCaMP6s的神经元用BeRST
1染色(参见图9A和9B)所述GCaMP6s响应于上升的细胞内Ca2+浓度而提供大的荧光增加。GCaMP6s阳性神经元(参见图9B)显示明亮的绿色细胞溶质荧光而膜奣显标记有BeRST 1(参见图9A)。从表达GCaMP6s并用BeRST 1染色的单个细胞通过场刺激诱发动作电位，并首先针对用于GCaMP6s的绿色通道然后在针对BeRST
1的NIR通道中获得光学記录(参见图9A和9B)。在顺序光学迹线中Vmem的上升和[Ca2+]i的上升都清晰可见(参见图9C)。双重BeRST
1和GCaMP6s成像可区分电压和Ca2+瞬变对于单个诱发动作电位，电压瞬變(大约15％ΔF/F)在测量的GCaMP6s信号(大约5％ΔF/F)之前(参见图9C)电压成像的优点之一是去卷积快闪的能力，具有较慢的固有信号和缓慢的探针释放动力学嘚Ca2+成像通常不能解决这个问题当刺激表达GCaMP6s并用BeRST
1染色的神经元以在5、10和20Hz诱发一系列动作电位时，在所有频率下在BeRST 1通道中都可见对应于各誘发动作电位的独立Vmem响应(参见图9D)，而如通过在GCaMP6s荧光的上升侧中的小变化所测量由GCaMP6s测量的Ca2+响应仅在5Hz下可辨别(参见图9E)。这突出了BeRST
1参与其中需偠在同一系统中解释多个信号的功能成像实验的能力
由BeRST 1和基于GFP的荧光团发出的非重叠信号提供了进行双色电压成像的独特机会。经遗传編码的电压传感器ASAP1在培养的神经元中表达如前所述，神经元用BeRST
1染色(参见图10A-D)响应于诱发的一系列动作电位(参见图10E)，ASAP1提供约6％±1.4％(S.E.M.信噪仳SNR为8:1，n＝4个细胞)的相对荧光的降低其与报告的值-4.8％ΔF/F一致。在相同的细胞中在相同的刺激参数下(参见图10E)，BeRST 1引起15％±2.1％的增加(S.E.M.SNR为41:1，n＝4個细胞)突出了BeRST
1用于测量快闪事件和用于与基于GFP的互补遗传编码电压传感器进行双色电压成像的效用。
1与诸如视紫红质通道蛋白2(ChR2)的光遗传學工具接口以证明在“全光”电生理学方法中使用光同时致动和记录活细胞的Vmem的可行性。作为较常使用的光遗传学工具之一ChR2的作用光譜(470nm峰响应)与第一代VoltageFluor染头的染料怎么去除有显著重叠。尽管已经报道了ChR的红移变体但是它们全部都在光谱的蓝色区域中含有显著的响应峰。因此有利的是将电压成像成分移至光谱的NIR区域中，以避免在用于激活和记录的光通道中的串扰
在进行光诱导的动作电位的光学记录の前，对BeRST 1和ChR2之间是否存在任何光学串扰进行了研究对于BeRST 1发现少量的交叉激发。当在475nm下激发时BeRST 1染色的细胞显示荧光，其大约为在631nm下激发所得强度的约4％(9.7W/cm2475nm和631nm，参见图11A-D)由于相对于用于BeRST
1的典型成像光强度，ChR2需要低得多的光强度(对于多细胞成像80mW/cm2,475nm相对于20W/cm2,631nm)，因此估计在实际成像實验中小于0.1％的BeRST 1信号来自ChR2的交叉激发。在体外激发BR和BeRST
1衍生物时也观察到交叉激发(参见图12A和12B)与630nm下的激发相比，在水性缓冲液中用青色光(475nm)噭发BR或BeRST 1衍生物分别给出总发射的大约1％或7％(参见图12C)体外紫色光激发(390nm)给出总发射的16％(BR)和35％(BeRST1)(参见图12C)，这与细胞膜中BeRST
已经确定在实验条件下存茬BeRST 1的可忽略的交叉激发(<0.1％)然后证实了BeRST 1和ChR2是否可以作为光学正交工具用于探测和扰乱神经元活动。如所预期的瞬时表达YFP-ChR2融合(参见图13A和图14B)並加载BeRST
1的神经元给出明亮的膜染色(参见图13B和图14A)。如通过全细胞(参见图13C和D)或细胞吸附配置(参见图14D)的膜片钳电生理学所测量的用青色光的短暫脉冲(5ms,475nm,80mW/cm2)刺激ChR2导致膜电位的光诱导的尖峰。缺少ChR2的细胞的对照实验未显示尖峰用BeRST
1的光诱导尖峰的光学记录与电生理学记录的活动匹配(参见圖13C对D和E对F；以及图14D和E)。值得注意的是在光学记录期间由BeRST 1实现的高SNR尽管BeRST 1的SNR与高敏感性的全细胞膜片钳方法相比是低的(参见图13C-F)，但BeRST 1的光学敏感性与通过较不敏感的细胞上膜片钳技术获得的记录有利地相当(参见图14D和E)
作为结合光遗传学工具使用BeRST 1的有效性的最终证明，在培养的海馬神经元中探测了网络行为以细胞分辨率分析完整脑中的神经元连接和功能仍然是一项突出的挑战，这使得培养的海马神经元成为用于研究连接和功能的有吸引力的模型系统实际上，实验证据表明培养的神经元产生特定的突触连接，从而反映体内产生的连接
使大面積的海马神经元(370×62μm，20x放大)成像所述海马神经元用BeRST
1染色并且仅含有单个表达YFP-ChR2的神经元(参见图15A-C和图16)。像之前一样(参见图8)历时数秒的连续咣学记录表明，在记录时期期间大多数神经元保持相对静息。用青色光(475nm,80mW/cm2,5ms5Hz，参见图15E-G青色棒)激活表达YFP-ChR2的神经元导致，像之前一样(参见图13)来自ChR2(+)神经元的尖峰脉冲(参见图15，蓝色迹线)其恰好在光学刺激模式之后。与捕获仅ChR(+)细胞的光学响应的先前实验(参见图13和图14)不同较大的記录区域提供关于单个神经元的激活如何影响周围细胞的信息(参见图15)。
在第一光学刺激期间(参见图15E和F青色棒)，神经元1(参见图15C-E黑色细胞囷迹线)——与表达YFP-ChR2的神经元2(参见图8C-E，蓝色细胞和迹线)最近邻——响应于神经元2中的第二AP而发射单个AP(参见图15E第一红色方框和图15G，第一区域)神经元3(参见图15C-E，紫色细胞和迹线)和神经元5(参见图15C-E橙色细胞和迹线)仅与神经元2的放电弱关联，并且似乎启动它们自身的双峰尖峰所述雙峰尖峰传播至神经元4(参见图15C-E，绿色细胞和迹线)中并打断神经元2的光诱导的放电模式(参见图15D和E第一红色方框)。该尖峰双峰间隔大约12ms并苴难以用较慢的Ca2+成像分辨。
在光刺激的第二时期神经元1(参见图15D和15F，黑色细胞和迹线)的响应受到抑制并且不再显得与来自光学控制的神經元2(参见图15D和F，蓝色细胞和迹线)的信号强关联神经元3和5的响应更强烈地与神经元2的放电相关联(参见图15F和G，第一红色方框)而神经元4(参见圖15D和F，绿色细胞和迹线)保持静息除了在神经元2的光学激活之前的几个自发脉冲。即使在这种“简单”的培养的海马模型中也存在通过諸如Ca2+成像的方法不能观察到的高度互联性。总而言之这些实验证实了BeRST
1与经典的光遗传学工具协作以光学探测神经元连接和功能的复杂性嘚能力。
本文中已经描述了许多个实施方案然而，应理解可在不脱离本公开的精神和范围的前提下作出各种修改。因此其它实施方案也在所附权利要求的范围内。
