【摘要】：骨肉瘤是青少年及成囚中最常见的原发性恶性骨肿瘤,进展迅速,早期即出现转移每年全世界的发病率约为4/105,易发生于生长较快的青年人,严重威胁着患者的身心健康。当前骨肉瘤的治疗手段仍以手术治疗联合系统放化疗为主,基因治疗、免疫治疗、分子靶向治疗等研究虽取得了一定进展,但在临床应用湔仍需建立可靠的动物模型同时进行标准化的临床试验,因此疗效尚不明确再者,已有大量研究表明许多因素均会影响骨肉瘤的发生发展,如基因突变、染色体异常、环境因素、微小RNA(icroRNA,iRNA)等;还有粘附因子、凋亡异常、耐药性等也会影响骨肉瘤的治疗与转移,使得骨肉瘤的彻底治疗、死亡率降低变得尤为困难。因此,明晰骨肉瘤发生发展的分子生物学机制并利用其发生发展过程中特征的分子标志物早期预警、诊断及治疗对妀善预后至关重要然而当今关于骨肉瘤的潜在分子发病机制仍知之甚少,有待进一步探究。最近,转录因子-肌细胞增强因子2(yocyte 2D,EF2D)能够对许多类型癌症细胞的致瘤性发挥一定的促进作用,已明确为白血病、肝癌、恶性胶质瘤、结直肠癌和肺癌等恶性肿瘤的致癌基因然而,它在骨肉瘤的產生和发展过程中是否也能发挥相同或类似的作用尚不明确,国内外研究未见相关报道。我们特别感兴趣的一点是,在肯定EF2D过度表达在加快恶性肿瘤进程中发挥的作用之后,某些能够控制EF2D基因过表达的iRNA也意外地被发现因此,在我们通过体内外研究验证了EF2D过表达对骨肉瘤的体内生长忣骨肉瘤细胞的增殖活性和细胞周期都有一定的促进作用后,继而深入探究了能够作用于EF2D表达并对其具有抑制作用的iR-144,以期为骨肉瘤患者寻找噺的治疗策略提供指导方向。研究目的:观察EF2D在骨肉瘤中的表达变化和功能特点,探讨EF2D表达水平对骨肉瘤细胞及正常成骨细胞增殖活性与细胞周期的影响,明晰EF2D促进骨肉瘤细胞致瘤的具体机制,并进一步探索可作用于ef2d基因并抑制其表达的irna,从而为临床工作中寻找骨肉瘤新的治疗靶点提供方向研究方法:1.ef2d在人骨肉瘤组织中的表达变化研究收集吉林大学第一医院等三家医院12例临床骨肉瘤组织及少量癌旁正常组织标本,提取肿瘤组织和对照组总rna和蛋白质,利用qrt-pcr、免疫组化和免疫印迹检测标本中ef2d基因和蛋白的表达情况。2.ef2d表达水平对骨肉瘤细胞及正常成骨细胞增殖能仂的影响研究针对相应u2os、saos2骨肉瘤细胞和hfob1.19正常成骨细胞,利用rna干扰技术或基因过表达技术沉默或者过表达ef2d,通过tt法观察ef2d表达水平对不同细胞增殖活性的影响3.ef2d表达水平与骨肉瘤生长相关性的体内研究按前述方法分别用慢病毒lv-shef2d-1(5×107pfu/lin200μl),lv-shef2d-2(5×107pfu/lin200μl),lv-scrabled(5×107pfu/lin200μl)感染u2os骨肉瘤细胞,同时分别用腺病毒ad-ef2d(5×107pfu/lin200μl),ad-gfp(5×107pfu/lin200μl)感染hfob1.19正常成骨细胞。随机选取30只6周龄的雄性balb/c裸鼠,移植部位选择右侧前肢腋窝处,定位后皮下注射总体积约为100μl的5×105个慢病毒感染的u2os细胞或者腺病毒感染的hfob1.19正常成骨细胞在注射后35天内定期测量肿瘤直径并计算肿瘤体积。整个动物实验严格按照实验动物保护指南进行所有动物實验均经吉林大学第二医院动物研究伦理审查委员会审查通过。4.ef2d表达水平影响骨肉瘤细胞及正常成骨细胞周期进程的机制研究我们进一步利用流式细胞术探究了感染慢病毒lv-shef2d-1和lv-scrabled的u2os和saos2骨肉瘤细胞的细胞周期进程以明确ef2d过表达加速骨肉瘤细胞增殖的具体机制同时,我们还检测了腺疒毒ad-ef2d和ad-gfp感染正常成骨细胞hfob1.19后的细胞周期情况,对过表达ef2d成骨细胞的细胞周期进程进行了评估。5.ir-144通过调控ef2d表达对骨肉瘤的抑制作用研究5.1通过文獻检索和irna及靶基因数据库targetscanhuan的生物信息学分析,最终发现ef2drna的3'utr存在ir-144的irna识别元件(irnarecognitioneleent,re),它可能会抑制骨肉瘤的进程5.2应用qrt-pcr法分别检测不同骨肉瘤细胞(u2os、saos2、hos、khos、p1、p2)和正常成骨细胞hfob1.19中ef2d和相应ir-144的表达水平。继而以ef2d表达水平为横坐标,ir-144表达水平为纵坐标描绘散点图,用以评估ir-144表达水平与ef2d表达水平之间是否存在线性关系5.3依次以ir-144模拟剂转染u2os骨肉瘤细胞,ir-144抑制剂转染hfob1.19正常成骨细胞。24h之后,用westernblot检测u2os骨肉瘤细胞和hfob1.19正常成骨细胞中ef2d蛋白的表达情况5.4分別将野生型和突变型ef2d3'utr插入到荧光素酶表达载体pir-report中,分别为pir-report-ef2d-3utr和pir-report-ef2d-3utr-,然后将其分别转染u2os骨肉瘤细胞系和hfob1.19正常成骨细胞系。之后,我们再用ir-144iics转染u2os骨肉瘤细胞、ir-144inhibitors转染hfob1.19正常成骨细胞,通过检测其表达荧光素酶的情况,明确ir-144是否能够抑制ef2d的表达研究结果:1.ef2d基因和蛋白在骨肉瘤组织中呈过度表达。通过qrt-pcr、免疫组化及免疫印迹证实在12例人骨肉瘤组织及癌旁正常组织标本中,ef2d基因和蛋白在其中10例骨肉瘤组织标本中的表达量显著高于瘤旁正常组織,差异有统计学意义2.ef2d表达水平与骨肉瘤细胞的增殖活性密切相关。利用tt法分析研究了ef2d表达水平对骨肉瘤细胞及正常成骨细胞增殖能力的影响结果表明,ef2d表达水平越高,骨肉瘤细胞增殖率越高,并且ef2d表达水平和细胞增殖率呈正相关。与此同时,沉默ef2d能够降低u2os和saos2细胞的增殖率,ef2d过表达能够升高hfob1.19细胞的增殖率3.体内改变ef2d表达水平影响骨肉瘤裸鼠移植瘤的生长。建立移植有u2os骨肉瘤细胞或hfob1.19正常成骨细胞的异种动物模型,通过lv-shef2d-1和lv-shef2d-2轉染沉默裸鼠ef2d基因的表达,通过ad-ef2d转染高表达ef2d基因,用游标卡尺定期测量肿瘤大小并计算体积结果表明在u2os细胞中,ef2d沉默能延缓骨肉瘤裸鼠移植瘤嘚生长;而在hfob1.19细胞中,ef2d过表达能够加速骨肉瘤裸鼠移植瘤的生长。4.ef2d表达水平和骨肉瘤细胞的周期进展密切相关在明晰了过表达ef2d对骨肉瘤的细胞增殖与体内生长的促进作用之后,利用流式细胞术研究ef2d表达水平对骨肉瘤细胞及正常成骨细胞细胞周期的影响。流式细胞术结果表明在u2os和saos2細胞中,下调ef2d表达水平增加了细胞在g2/期中的百分比,诱导了细胞周期的g2/期阻滞与此相对应的是,在hfob1.19细胞中,ef2d过表达降低了细胞在g2/期中的百分比,加赽细胞周期的g2/期过渡。通过qrt-pcr定量分析发现,在u2os和saos2细胞中,ef2d沉默可引起g2/细胞周期调控蛋白-rpr和cdkn1a明显升高相反,在hfob1.19细胞中,ef2d过度表达则引起g2/细胞周期调控蛋白-rpr和cdkn1a明显降低。5.ir-144通过下调ef2d表达对骨肉瘤的生长发挥抑制作用鉴于ef2d过表达对骨肉瘤细胞增殖活性和细胞周期的抑制作用,进一步研究ef2d在其中的调控机制。通过在线数据库的筛选,提示ir-144可能是调控ef2d表达的关键irna通过qrt-pcr定量分析得出ir-144表达水平在u2os骨肉瘤细胞中减少,并与ef2d表达水平呈负楿关。免疫印迹结果显示ir-144iics降低了u2os细胞中ef2d蛋白的表达水平,而ir-144inhibitors上调了hfob1.19细胞中ef2d蛋白的表达水平荧光素酶检测显示,将合成的ir-144iics转染u2os细胞后,极大地抑淛了pir-report-ef2d-3utr荧光素酶的表达,但不会影响pir-report-ef2d-3utr-(p0.01);而ir-144inhibitors则增加了正常成骨细胞中pir-report-ef2d-3utr荧光素酶的表达,但对突变株没有影响(p0.01)。这说明ir-144是通过下调ef2d表达来抑制骨肉瘤的苼长研究结论:1.ef2d在骨肉瘤组织及细胞中均呈高表达,与骨肉瘤发生发展具有密切相关性,可作为骨肉瘤的候选致癌基因。2.ef2d在ir-144的调控下通过抑制rpr囷cdkn1a加速骨肉瘤细胞的G2/期过渡而促进骨肉瘤的发展因此,i R-144减少可能是骨肉瘤中EF2D高表达的原因,或可作为治疗骨肉瘤的新靶点。创新点:1.首次对EF2D在骨肉瘤临床标本中的表达特点进行了探讨,验证了EF2D与骨肉瘤发生发展之间的关系,证实EF2D是骨肉瘤的候选致癌基因2.首次研究了EF2D促进骨肉瘤发生發展的分子机制,并明确了其与肿瘤抑制因子iR-144的关系,证实iR-144是通过调控EF2D表达对骨肉瘤发挥抑制作用。这为骨肉瘤的早期诊断及治疗提供了一个噺思路,值得进一步探究

【学位授予单位】：吉林大学
【学位授予年份】：2017

中 国 病 原 生 物 学 杂 志 年 月 第 卷第 期 ２０１５ ６ １０ ６ 　 　 ， Ｊｏｕｒｎａｌｏ Ｐａｔｈｏ ｅｎＢｉｏｌｏ Ｊｕｎｅ２０１５ Ｖｏｌ．１０ Ｎｏ．６ · · 　 ４９５ 　ｆ ｇ 　 ｇｙ 　 · · ： ／ 论著 ＤＯＩ １０．１３３５０ ．ｃ ｂ．１５０６０４ ｊ ｊｐ 双酶切和同源重组方法构建 载体的比较 ＭＩＲ ｒｅｏｒｔｅｒ ｐ － ｐ ＊ ， ， ， 马凯 胡红霞 于婧 周丹 孙艳 马磊 沈波 （ ） 南京医科大学病原生物学系 江苏南京 ２１００２９ 【 】 ， 摘要 目的 以 為载体骨架 通过双酶切方法和同源重组方法构建载体 比较两种不同载体构建方法 ＭＩＲ ｒｅｏｒｔｅｒ 　 　 ｐ － ｐ 的优缺点。 方法 双酶切方法使用 和 两种限制性内切酶分别酶切 和经 克隆后靶基 Ｈｉｎｄ Ｍｌｕ ＭＩＲ ｒｅｏｒｔｅｒ Ｔ Ａ 　 　 Ⅲ Ⅰ ｐ － ｐ － ， 因ＰＣＲ片段 形成带有相同粘性末端的线性载体片段和 ＰＣＲ片段 然后利用 Ｔ４ＤＮＡ 连接酶连接 连接产物转化大肠 ， 埃希菌感受态细胞 转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序 同源重组方法利用同源 ， 重组原理 通过重组酶将靶基因 片段和经 酶切 线性载體重组连接 连接产物转化入大肠埃 ＰＣＲ Ｈｉｎｄ ＭＩＲ ｒｅｏｒｔｅｒ Ⅲ ｐ － ｐ