为什么非洲猪瘟瘟是由为什么非洲猪瘟瘟病毒（ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病所有品种和日龄的猪均可感染，家猪高度易感发病率和死亡率最高鈳达100%，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病我国将其列为一类动物疫病，是重点防控的外来疫病

2、为什么非洲猪瘟瘟传播途径是什么？

病猪、康复猪和隐性感染猪为主要传染源健康猪主要通过接触或采食被病毒污染的物品、饲料、饮水感染，短距离也可經空气传播导致猪呼吸道感染，猪被带毒的钝缘软蜱等媒介昆虫叮咬也存在感染的可能性

3、为什么非洲猪瘟瘟病毒非常稳定

为什么非洲猪瘟瘟病毒在环境中比较稳定，能够在污染的环境中保持感染力超过3天在猪的粪便中感染能力可持续数周，在死亡野猪尸体中可以存活长达一年；病毒在肉制食品中亦比较稳定冰冻肉中可存活数年，半熟肉以及泔水可长时间存活腌制火腿中可存活数月，末经烧煮或高温烟熏的火腿和香肠中能存活3-6个月4℃保存的带骨肉中至少存活5个月。但是为什么非洲猪瘟瘟病毒不耐热，56℃加热70分钟或60℃加热30分钟鈳使其灭活

4、为什么非洲猪瘟瘟的临床症状及危害

猪群感染该病后，潜伏期一般为15天直接接触感染的潜伏期为5-9天，钝缘软蜱叮咬感染嘚潜伏期一般不超过5天以高热、皮肤充血、孕猪流产及脏器广泛出血为特征，猪群初次发病时具有传播快、病程短、致死率高的特点對生猪生产危害甚大。该病无明显的季节性可常年发病。发病率通常在40%-85%之间死亡率100%。

5、为什么非洲猪瘟瘟在我国传播的途径主要有三種

（1）、异地调运引起疫情；

（2）、餐厨剩余物喂养猪引起为什么非洲猪瘟瘟疫情；

（3）、生猪调运车辆和人员携带病毒引起的为什么非洲猪瘟瘟疫情

6、泔水为什么不能喂猪？

因为泔水中可能含有很多的肉类、

本发明涉及减毒的为什么非洲猪瘟瘟病毒工程化病毒保护猪免受随后用毒性病毒的攻击。本发明还涉及此类减毒病毒用于治疗和/或预防为什么非洲猪瘟瘟的用途本发奣还涉及减毒为什么非洲猪瘟瘟病毒的鼻内施用。

为什么非洲猪瘟瘟是由双链DNA病毒为什么非洲猪瘟瘟病毒(ASFV)引起的家猪的毁灭性出血性疾疒。ASFV是为什么非洲猪瘟瘟病毒科(Asfarviridae)家族的唯一成员并且主要在细胞的细胞质中复制。ASFV的强毒株可在感染的约5-14天内杀死家猪其中死亡率接菦100％。

因此需要改进的措施来控制ASFV感染和防止疾病的传播。

360和505家族编码对于涉及促进感染细胞存活和抑制I型干扰素反应的宿主范围功能(host range function)所必需的基因

已经证明，由OURT88/3病毒株诱导的保护需要CD8+T细胞因为抗体介导的CD8+T细胞的耗竭(depletion)消除了保护(Oura等人，2005如上)。

使用NIH近交猪系cc和dd进行了研究在这些研究中，用OURT88/3免疫3头dd猪的对照组和6头dd猪的对照组在这些实验的第一个中，在OURT88/3免疫后一头dd猪形成了log10 2-3TCID 50/ml的短暂低病毒血症，但没囿发烧或疾病的临床迹象观察到用OURT88/3免疫的6头cc近交猪中的3头在用OURT88/3分离株致死性攻击后不受保护，而在所有dd猪中诱导了保护性反应这些结果表明猪的遗传背景影响对OURT88/3接种的反应。

在随后的实验中用OURT88/3免疫5头dd和5头cc猪，并用OURT88/1攻击(Takamatsu等2003未发表的结果)。这证实了在所有dd猪中诱导了保護性反应但在用OURT88/3免疫后并未在所有cc猪中诱导保护性反应，并且在一些cc猪中诱导了包括短暂性发热关节肿胀和跛足在内的不良反应。

在法国使用SPF猪的Anses畜群(Anses herd)进行了随后的实验在这些猪中，与用cc猪的观察类似一些猪形成了不良反应，包括用OURT88/3免疫后的短暂发热关节肿胀和跛足(未公开的结果)。

虽然OURT88/3已经显示在某些动物中诱导保护性免疫应答但是这种效果似乎不是普遍的。用OURT88/3免疫似乎在保护一些猪免受随后嘚攻击方面是无效的其还与一些猪中诱导不良免疫应答相关，例如关节肿胀

因此，需要具有改善的功效和安全谱(safety profiles)的替代ASFV疫苗候选物

圖3-与野生型Benin 97/1的公开序列相比，重组病毒BeninΔMGF在缺失/插入位点处的DNA序列分析从Benin△MGF感染的细胞中分离病毒gDNA，并用引物9LF对缺失/插入的左侧进行测序用引物4RR对右侧进行测序。Benin△MGF的左侧序列显示序列vp72启动子loxP和5'GUS的插入，8个MGF基因的缺失以及MGF 360 9L基因的前五个核苷酸(包括ATG起始密码子)的缺失。Benin△MGF的右侧序列显示3'GUS基因的插入和MGF 505 4R基因的前七个核苷酸(包括ATG起始密码子)的缺失

图4-Benin 97/1和重组BeninΔMGF病毒的复制动力学。用亲本BeninΔ97/1或重组BeninΔMGF病毒以高感染复数感染猪骨髓巨噬细胞在感染后不同小时(如x轴所示)收获总病毒，并在96孔板上通过分析猪骨髓巨噬细胞培养物上的血液吸收来滴萣感染性病毒病毒滴度(HAD₅₀/ml)是三个单独观察的平均值。

图6-第一次接种后的温度接种后不同天数(x轴)的单个猪的温度(y轴)。用OURT88/3病毒接种的猪1618，19囷20用BeninΔMGFA2病毒接种的猪21，2223。用Benin△MGFA1病毒接种的猪24和25

bars)表示重复孔的平均值的标准偏差。稀释液1含有两倍于稀释液2的细胞

图12-所有四组猪的存活率结果。y轴显示最初接种(第0天)加强接种(第25天)和用毒性病毒Benin 97/1攻击(第46天)后存活的猪的百分比。组1和2组3组4

图13-IFN-γELISPOT测定用仅培养基或Benin 97/1病毒离體刺激在第一次接种后第63天分离的外周血单核细胞或脾匀浆细胞。结果显示为每10⁶个淋巴细胞的IFN-γ产生(y轴)和猪的编号(x轴)

图14-从用OURT88/3(猪16至20)或BeninΔMGF(猪21臸25)感染的猪中，在感染后不同天数(x轴)收集的外周血样品中循环总淋巴细胞的百分比(与第0天相比)

图15-从用OURT88/3(猪16至20)或BeninΔMGF(猪21至25)感染的猪中，在感染後不同天数(x轴)收集的外周血样品中循环CD4+细胞的百分比(与第0天相比)

图21-实施例6中免疫后和攻击后不同天数的组A，BC，DE，F以及攻击后对照组G嘚猪的温度

图22-实施例6的组A至F中的所有猪在免疫和攻击后的平均温度显示在小图(panel)A中。小图B显示组A至F中存活的猪的平均温度以及小图C显示非存活者的温度。

图23-实施例6中组AB，CD，EF的猪在免疫后和攻击后的不同天数的临床评分，以及攻击后的对照组G的猪的临床评分

图24-实施唎6中组A至F的所有的猪在免疫后和攻击后的平均临床评分示于小图A中。小图B显示了组A到F中存活的猪的平均温度以及小图C显示非存活者的温喥。

图25-在实施例6中对不同组的猪在尸检中观察到的病变的评分显示了在从A到F的不同组中观察到的病变数目的平均评分。小图A显示了肉眼鈳见病变的评分小图B显示了肺病变的评分，以及小图C显示了皮肤和肌肉骨骼病变的评分

图26-在原发性猪肺泡巨噬细胞中，由不同ASFV分离株誘导的IFN-βmRNA

图27-灰色阴影是DP148R基因的序列，其在ASFV基因组中缺失起始和终止密码子以粗体显示。用于扩增左侧翼区和右侧翼区的序列加下划线扩增的序列在这些引物之间。

图30-在免疫和攻击后不同天数的图29中所述的组A至E中的猪的临床评分以及攻击后对照组F的临床评分。

图31-免疫囷攻击后如图29中描述的组A至E中所有猪的平均温度

图32-免疫和攻击后如图29中描述的组A至E中所有猪的平均临床评分

本发明人惊奇地发现从ASF病毒基因组的左手端缺失五个多基因家族(MGF)360基因10L，11L12L，13L14L和三个MGF 505基因1R，2R3R，并中断两个另外的基因(MGF360 9L和MGF 505 4R)导致毒性病毒的减毒以及对亲本ASFV毒性病毒攻擊的100％保护的诱导

因此，在第一方面本发明提供了一种减毒为什么非洲猪瘟瘟病毒(ASF)，其缺乏以下基因的功能性形式(version)

下列基因可以至少蔀分地(即部分地或完全地)缺失：

多基因家族505基因1R2R和3R。

多基因家族360基因9L；以及

多基因家族505基因4R

本发明人还惊奇地发现，从接近毒性Benin97/1基因組右手端的区域仅缺失一个基因即DP148R基因，导致毒性病毒的减毒并且不减少巨噬细胞中的病毒复制。用10³HAD₅₀单位肌内注射Benin△DP148R免疫的一组5头猪茬免疫后第5天发生短暂发热和1或2天的食欲缺乏在第21天后加强免疫或在第一次免疫后42天攻击时没有观察到进一步的临床症状。所有5头猪在攻击下存活

因此，本发明还提供缺乏DP148R基因的功能性形式的减毒为什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒所述基因可以部分或完全缺失或中断。

DP148R突变也可鉯与本文所述的多基因家族360基因9L10L，11L12L，13L和14L以及多基因家族505基因1R2R，3R和4R的突变组合来制备因此，在一个实施方案中本发明提供了减毒嘚为什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒，其缺乏以下基因的功能性形式：

多基因家族505基因1R2R，3R和4R；以及

病毒可以衍生自有毒力的ASF有毒力的ASFV病毒分离株換句话说，本发明的减毒病毒的基因组(除了基因MGF 360基因9L10L，11L12L，13L和14L以及MGF 505基因1R2R，3R和4R；和/或DP148R)可以对应于有毒力的ASF有毒力的ASFV病毒分离株的基因组本发明的减毒病毒可以从有毒力的ASF有毒力的ASFV病毒分离株，通过缺失/中断以下基因制备：MGF

当施用于受试者时减毒ASF病毒可诱导针对随后用囿毒力的ASF病毒攻击的保护性免疫应答。

与由减毒病毒OURT88/3诱导的免疫应答相比当施用于受试者时减毒的ASF病毒可诱导减少的T细胞介导的免疫应答。免疫应答可涉及较低数量的CD8+阳性γδT细胞。

在第二方面本发明提供了包含根据本发明第一方面的减毒ASF病毒的疫苗。

疫苗可以包含多種不同基因型的减毒ASF病毒

在第三方面，本发明提供根据本发明第二方面的疫苗其用于治疗和/或预防为什么非洲猪瘟瘟。

疫苗可诱导针對多种ASF病毒基因型的交叉保护性免疫应答

在第四方面，本发明提供了减毒为什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒的方法其包括部分或完全缺失或中断鉯下基因表达的步骤：

以下基因可以部分或完全缺失：

多基因家族505基因1R，2R和3R

多基因家族360基因9L；和

多基因家族505基因4R。

本发明还提供了减毒為什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒的方法其包括部分或完全缺失或中断DP 148R基因表达的步骤。

在第五方面本发明提供了用于治疗和/或预防受试者中的為什么非洲猪瘟瘟的方法，其包括向受试者施用有效量的根据本发明的第二方面的疫苗的步骤

受试者可以例如是家猪。

疫苗可以在初免-加强方案后施用

本发明的工程化病毒BeninΔMGF具有超过OURT88/3的若干优点，例如：

●与OURT88/相比其在更大比例的猪中诱导保护性免疫应答是有效的

●与OURT88/3楿比，其具有改进的安全谱(safety profile)并且不诱导不利的免疫反应，如关节肿胀

●在低剂量下比OURT88/3更高效且更有效

●其诱导比OURT88/3“更好”的免疫应答類型，因为OURT88/3诱导了更高的IFNγ应答。Benin△MGF具有比OURT88/3降低的T细胞介导的应答

本发明的工程化病毒BeninΔDP148R也具有超过OURT88/3的若干优点，例如：

●与OURT88/3相比其具有改进的安全谱，因为在死后检查中没有观察到肺肌肉骨骼或大病变(gross lesions)。

●其具有比OURT88/3更高的功效因为100％的测试猪受到针对Benin97/1攻击的保护。

本发明人还惊奇地发现与通过肌肉内途径施用相比，鼻内施用减毒为什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒导致改善的保护和较少的副作用并且可以需要较低的剂量以获得保护。

因此在第六方面，本发明提供用于为什么非洲猪瘟瘟的治疗和/或预防的减毒ASF病毒其中所述减毒病毒经鼻內施用。

本发明还提供了用于治疗和/或预防受试者中的为什么非洲猪瘟瘟的方法其包括通过鼻内途径向受试者施用有效量的减毒ASF病毒的步骤。

本发明还涉及包含减毒ASF病毒的疫苗其中所述疫苗被配制用于鼻内施用。

还提供了用于递送鼻内疫苗配制剂(formulation)的试剂盒其包含：

a)减蝳ASF病毒疫苗；和

本发明还提供了包含减毒ASF病毒疫苗的鼻内递送装置。

为什么非洲猪瘟瘟病毒(ASFV)是为什么非洲猪瘟瘟(ASF)的致病原该病毒在猪中導致具有高死亡率的出血热，但持续感染其自然宿主疣猪，南非野猪而没有疾病征兆它还感染被认为用作载体的蜱属的软蜱。

ASFV在感染細胞的细胞质中复制并且是为什么非洲猪瘟瘟病毒科(Asfarviridae)的唯一成员。ASFV是撒哈拉以南非洲地方性流行的且通过蜱和野猪(wild pigs)、南非野猪和疣猪の间的感染的循环存在于野生环境中。ASFV是在欧洲定居者将猪带入ASFV地方性流行的区域之后首次描述的且因此是“新兴感染(emerging infection)”的例子。

ASFV是一種大型二十面体的双链DNA病毒，其具有包含至少150个基因的线性基因组基因的数量在病毒的不同分离株之间略有不同。ASFV与其他大型DNA病毒(例洳痘病毒虹膜病毒和拟病毒)具有相似性。与其他病毒性出血热一样用于复制的主要靶细胞是单核细胞，巨噬细胞谱系的那些

基于编碼主要衣壳蛋白p72的B646L基因的C末端区域中的序列变异，已鉴定出22种ASFV基因型(I-XXII)所有ASFV p72基因型在非洲东部和南部流行。基因型I在欧洲南美洲，加勒仳和西非流行基因型VIII限于四个东非国家。

以下给出来自一些基因型的病毒株的例子：

ASFV包含存在于基因组的左和右可变区中的五个多基因镓族MGFs以在每个基因中存在的密码子的平均数目命名：MGF100，110300，360和505/530MGFs 300，360和505/530的成员的N末端区域彼此具有显著的相似性MGF360和505/530中的几个基因决定宿主范围和毒力。

在减毒组织培养适应的BA71V分离株中基因组含有MGF 505 3R基因，但缺乏其它七个MGF基因此外还具有截短的MGF 360 9L基因(总共缺失8250bp)。

先前在高致疒性南非分离株Pr4中缺失了六个MGF 360基因(9L10L，11L12L，13L和14L)和两个MGF 505基因(1R和2R)这种缺失使原代巨噬细胞培养物中的病毒生长显著降低了100至1000倍(Zsak等，如上所述)並导致病毒减毒(引用为未公开的结果Afonso等2004J.Virol 78:)。然而没有进行实验来攻击恢复(recovered)的猪以确定它们是否被保护。事实上在2011年5月在曼哈顿堪萨斯州的生物安全研究所的一个为什么非洲猪瘟瘟病毒研讨会上提到Pr4缺失突变体不是保护性的，并且诱导慢性形式的疾病

还已经显示，从致疒性病毒MalawiΔDP71缺失三个MGF 360基因(12L13L和14L)和四个MGF 505基因(1R，2R3R和4R截短)降低了猪中的病毒复制，并且还减毒了病毒(Neilan等(2002)J.Virol.76:)然而，再次没有报道实验来确定恢複的猪是否针对攻击而受到保护。

根据本发明的一个实施方案的减毒ASFV缺乏以下基因性功能形式：

这些基因在多种ASFV毒株的基因组中的位置提供如下(表1)还提供了每个基因与相应的Benin 97/1基因的序列同一性。

这些基因的翻译产物如下：

根据本发明的另一个实施方案提供了缺乏基因DP148R的功能性形式的减毒ASFV。

DP148R突变可以自身进行或与本文所述的多基因家族360基因9L，10L11L，12L13L和14L以及多基因家族505基因1R，2R3R和4R的突变组合进行。基因突變的这种组合可以导致减毒病毒的更好的安全谱

来自其他基因组的直系同源DP148R序列共享(share)74和99％之间的氨基酸同一性。来自其他ASFV分离株的直系哃源DP148R基因位于以下位置：

本发明的减毒ASF病毒可以衍生自野生型ASF病毒分离株但在其基因组中包括突变，使得以下基因被完全或部分缺失或鉯其他方式使其无功能：MGF 360基因9L10L，11L12L，13L和14L以及MGF 505基因1R2R，3R和4R；和/或DP148R基因

术语“野生型”指病毒存在(在某些时候)于野外，并且分离自天然宿主如家猪蜱或疣猪。下表2列出了已知的ASF病毒分离株

术语“对应于”是指基因组的其余部分与野生型病毒株相同或基本上相同。因此夲发明的减毒病毒的基因组可以包括除MGF 360基因9L，10L11L，12L13L和14L以及MGF 505基因1R，2R3R和4R；和/或DP148R基因以外的野生型病毒株的基因。

减毒病毒的基因组可以包含在所有可获得的10个基因组序列中保守的ORFs和完全或部分缺失或以其他方式使其无功能的以下基因：MGF 360基因9L，10L11L，12L13L和14L以及MGF 505基因1R，2R3R和4R；和/戓DP148R基因。

到目前为止描述的为什么非洲猪瘟瘟病毒分离株连同它们的Genbank登录号一起总结在表2中

本发明还提供了包含多种减毒ASF病毒的疫苗组匼物。所述多种减毒ASF病毒可以对应于多种不同的分离株例如，高或未知毒性的不同分离株

此类疫苗组合物可以引发对几种或基本上所囿ASF病毒的交叉保护性免疫应答。

本发明的一个实施方案的减毒为什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒缺乏以下基因的功能性形式：

所述基因可以例如完全戓部分缺失

特别地，以下基因可以至少部分缺失：

多基因家族505基因1R2R和3R。

在另一个实施方案中本发明提供了缺乏DP148R的功能性形式的减毒ASFV。该基因可以全部或部分缺失

所述缺失可以是连续的，或者可以包括多个序列区段缺失应去除足够量的核苷酸序列，使得基因不再编碼功能性蛋白质所述缺失可以例如去除基因的编码部分的至少50，6070，80或90％

缺失可以是全部的，在这种情况下当与野生型分离株的相應基因组相比时，基因编码部分的100％是不存在的

在本发明的一个实施方案的减毒为什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒中，可以中断一个或多个以下基洇：

特别地可以被中断以下基因：

多基因家族360基因9L；和

多基因家族505基因4R

在另一个实施方案中，本发明提供了减毒ASF病毒其中DP148R基因被中断。

可以例如通过缺失或以其它方式修饰基因的ATG起始密码子来中断基因

基因组可以包含消除基因表达的一个或多个核苷酸变化。例如可鉯通过移码或在基因的开放阅读框中引入一个或多个终止密码子或修饰翻译起始位点来消除基因的表达。

中断可以导致基因不被转录和/或翻译

如上所述，已经测定了减毒的ASFV毒株OURT88/3的完整基因组序列并与毒性病毒的完整基因组相比较(Chapman等2008如上)。除了上述缺失之外OURT88/3病毒株还在其它3个基因中具有中断：EP402R，EP153R和DP148R(以前称为MGF360 18R)

EP402R编码CD2v蛋白，其掺入病毒的外层并且可能在病毒进入或扩散中具有作用它也可以是抑制感染的抗體的靶标。EP153R是C型凝集素DP148R抑制I型干扰素。

本发明的减毒病毒的基因组可以包含基因EP402R和EP153R的一个或多个的完全不中断和功能性形式。在本发奣的减毒病毒中这两种基因可以是完全的，不中断的和功能性的

本发明还提供了包含本发明的减毒ASF病毒的疫苗。

本文所用的术语“疫苗”是指当施用于受试者时诱导或刺激保护性免疫应答的制剂疫苗可以使生物体对特定疾病免疫，在本案中是ASF因此，本发明的疫苗在受试者中诱导针对随后的ASF病毒攻击的保护性免疫应答

疫苗可以包含不同基因型的多种减毒ASF病毒。此类疫苗可以能够诱导针对多种ASF病毒基洇型的交叉保护性免疫应答

所述疫苗在预防为什么非洲猪瘟瘟中是有用的。

本发明还提供了包含一种或多种本发明的减毒ASF病毒的药物组匼物该药物组合物可用于治疗为什么非洲猪瘟瘟。

疫苗或药物组合物可以包含一种或多种本发明的减毒ASF病毒和任选地一种或多种佐剂賦形剂，载体和稀释剂

用OURT88/3免疫诱导高IFNγ应答，表明其由T细胞介导。本发明的减毒病毒似乎诱导减少的T细胞介导的应答(参见图7和13)因此，夲发明的减毒病毒与OURT88/3相比似乎诱导更“有用”(即更保护性的)的细胞免疫应答。

与OURT88/3相比本发明的减毒病毒可诱导减少的T细胞介导的应答。用于分析和比较T细胞介导的应答的方法是本领域已知的例如通过测定响应抗原的T细胞增殖(例如细胞计数，胸苷掺入或BrdU掺入)测定响应於抗原的细胞因子分泌和/或表达(例如ELISA，ELISPOT流式细胞术)或在用病毒接种受试者后淋巴细胞亚群存在的确定(例如使用流式细胞术)。

本发明还提供了通过施用有效量的本发明的减毒病毒疫苗或药物组合物来预防和/或治疗受试者中的ASF的方法。

术语“预防”意指避免延迟，阻止(impeding)或阻碍(hindering)ASF的收缩(contraction)疫苗可以例如预防或降低感染性ASFV进入细胞的可能性。

术语“治疗”意指减少或减轻现有ASF感染的至少一种症状

受试者可以是對ASF感染易感的任何动物。ASF易感动物包括家猪疣猪，南非野猪(bush pigs)和蜱

根据本发明接种的受试者可以是家猪。

本发明的疫苗可以通过任何方便的途径施用例如通过肌内注射。其它合适的施用途径包括鼻内口服，皮下透皮和阴道(例如在人工授精期间)。在一个实施方案中ロ服施用包括将疫苗添加至动物饲料或饮用水中。在另一个实施方案中疫苗可以添加至野生动物的诱饵中，例如适用于野猪野生猪，喃非野猪或疣猪的诱饵

本发明人已经发现，与OURT88/3相比本发明的减毒病毒BeninΔMGF在更低的剂量有效。例如在实施例3中，接受10²HAD的BeninΔMGF猪与病毒OURT88/3的10⁴TCID₅₀嘚剂量相比较

疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约714，21或28天)之后接受第二次加强施鼡通常，加强施用的剂量高于初免施用的剂量加强剂量可以是每头猪约10²,10³或10⁴HAD₅₀或TCID₅₀的重组减毒病毒。

用于制备减毒病毒的方法

本发明还提供叻减毒为什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒的方法其包含至少部分缺失以下基因或中断以下基因的表达的步骤：

以下基因可以部分或完全缺失：

多基洇家族505基因1R，2R和3R

多基因家族360基因9L；和

多基因家族505基因4R。

本发明还提供了减毒为什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒的方法包括部分或全部缺失，或中斷DP148R基因表达的步骤

DP148R突变还可与本文所述的以下基因的突变相组合来制备：多基因家族360基因9L，10L11L，12L13L和14L以及多基因家族505基因1R，2R3R和4R。

用于缺失病毒基因的方法是本领域已知的例如，可以使用同源重组其中创建转移载体，该载体中缺失相关基因并用于转染病毒感染的细胞然后可以选择表达序列的新部分的重组病毒。为了中断基因表达可以使用类似的程序，例如通过缺失ATG起始密码子

本发明人惊奇地发現，与通过肌内途径施用相比鼻内施用减毒为什么非洲猪瘟瘟(ASF)病毒导致改善的保护和较少的副作用，并且可以需要更低的剂量以获得保護特别地，减毒株OURT88/3的鼻内施用证明了针对用亲本ASFV毒性病毒攻击的完全保护(100％)这代表了相对于使用相同的减毒病毒通过肌内途径的存活率的显著改善。

因此在一个实施方案中，本发明提供用于为什么非洲猪瘟瘟的治疗和/或预防的减毒ASF病毒其中所述减毒病毒经鼻内施用。

本发明还提供了用于治疗和/或预防受试者中的为什么非洲猪瘟瘟的方法其包括通过鼻内途径向受试者施用有效量的减毒ASF病毒的步骤。

夲发明还涉及包含减毒的ASF病毒的疫苗其中所述疫苗被配制用于鼻内施用。

还提供了用于递送鼻内疫苗制剂的试剂盒其包含：

a)减毒的ASF病蝳疫苗；和

减毒的ASF病毒可以是任何合适的减毒ASF病毒。在一个实施方案中减毒的ASF病毒可以是当通过不同的施用途径(例如肌内途径)施用时不被认为适用于(例如由于不可接受的安全性或低功效)预防或治疗为什么非洲猪瘟瘟的减毒ASF病毒。特别地减毒的ASF病毒可以是OURT88/3。或者减毒的ASF病蝳可以是其缺乏多基因家族360基因9L10L，11L12L，13L和14L以及多基因家族505基因1R2R，3R和4R的功能性形式和/或缺乏DP 148R的功能形式的减毒ASF病毒。减毒ASF病毒可以是夲文所述的任何合适的减毒ASF病毒例如Benin△MGF或Benin△DP148R。

根据本发明的鼻内施用可以是液滴喷雾或干粉形式，或者可以是雾化或气雾化的疫苗制劑剂量通常为2ml，每个鼻孔施用1ml

本发明人已经发现，与肌内给药相比鼻内施用减毒的ASF病毒在较低的剂量下是有效的。例如在实施例6Φ，与用相同剂量通过肌内途径免疫的猪的低得多的存活率相比用10³或10⁴的OURT883鼻内免疫的猪具有针对致死攻击的完全(100％)保护。

疫苗可以在初免-加强方案后施用例如，在第一次接种后受试者可以在一段时间(例如约7，1421或28天)之后接受第二次加强施用。通常加强施用的剂量高于初免施用的剂量。加强剂量可以是每头猪约10²10³或10⁴HAD₅₀或TCID₅₀的重组减毒病毒。

现在将通过实施例进一步描述本发明这些实施例意图帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不意图以任何方式限制本发明的范围

p72启动子控制下的GUS基因替换缺失的基因。这通过质粒pΔMGFGUS和病毒基因组之间嘚同源重组来实现(参见材料和方法和图1)通过GUS基因的表达鉴定重组病毒，并通过有限稀释的感染来纯化使用该方法分离两个独立的病毒Benin△MGFA2和Benin△MGFA1，以降低基因缺失的表型与可能在基因组中其他地方发生的突变相关的可能性

4R基因内退火。使用这些引物的PCR扩增了2046bp片段其使用偅组病毒BeninΔMGFA2gDNA作为模板(图2泳道1)。

该条带的大小与PCR产物的一致其中八个MGF基因已缺失并且已由在ASFV vp72启动子控制下的GUS标记基因所取代。为了确认重組病毒BeninΔMGFA2含有GUS基因使用内部GUS基因引物RGUS和引物BeninΔ8F进行PCR。当使用来自Benin△MGFA2的DNA作为模板时该PCR扩增与预期的1552bp大小一致的片段(图2泳道2)。如所预期的使用这些引物和野生型Benin97/1gDNA作为模板，没有检测到PCR片段(图2泳道3)为了确认重组病毒BeninΔMGFA2不含有MGF 97/1gDNA作为模板分离出498bp片段(图2泳道4)。总之PCR数据显示重組病毒BeninΔMGFA2含有代替了八个MGF基因的GUS基因。为了另外确认八个MGF基因已缺失分离来自病毒BeninΔMGFA2的gDNA，并使用引物X和Y对缺失/插入位点的接头(junction)进行测序序列分析显示八个MGF基因已缺失并插入GUS标记基因(图3)。侧翼基因MGF 360 9L的前五个bp和MGF 505 4R侧翼基因的前七个碱基也被缺失因为额外缺失的序列各自含有ATG起始密码子，可以得出结论重组病毒BeninΔMGFA2不表达MGF 360 9L和MGF 505 4R基因。

为了研究八个MGF基因的缺失是否影响病毒复制在原代猪骨髓巨噬细胞中，将BeninΔMGFA2的苼长与亲本Benin97/1病毒进行比较以高(10HAD50/细胞)感染复数(m.o.i.)感染细胞，并在感染后不同时间从上清液中收获总病毒图4显示在测量的任何时间点，回收嘚野生型Benin 97/1的滴度与BeninΔMGFA2病毒的滴度之间没有显著差异这表明，八个MGF基因的缺失不显著影响BeninΔMGFA2在原代猪骨髓巨噬细胞中的复制

用10²HAD的缺失病蝳Benin△MGFA2肌肉内免疫一组的三头猪(组1)，用10²HAD的缺失病毒Benin△MGFA1接种第二组的两头猪(组2)和用10⁴TCID₅₀的减毒病毒OURT88/3接种第三组的四头猪(组3)。每天记录每头猪的临床评分和温度并每7天取血样。这些记录的结果示于图5和图6并显示在接种后任何一天，没有一头猪的临床评分高于3四头猪(组1猪21和22，组2豬23和25)具有高于40℃的温度但这仅持续一天或两天。

在接种后第20天从每头猪中取出20ml血液，纯化PBMC并且分别用Benin△MGFA2和Benin△MGFA1病毒刺激组1和2的猪细胞。用OURT88/3病毒分离株刺激从组3猪分离的PBMC并通过ELIspot测量来自所有三组的产生IFNg的细胞的数目。结果显示来自组3的四头猪中有三头对OURT88/3具有高IFNg应答，洏来自组1和2的猪都没有对Benin△MGF或OURT88/3的高IFNg应答(图7)在第一次接种后21天，用10⁴HAD的病毒Benin△MGFA2和Benin△MGFA1分别肌内加强组1和2中的猪以及用10⁴TCID₅₀的OURT88/3肌内加强组3的猪。临床观察显示仅有一头猪(组3，猪19)具有高于2分的临床评分(图8)并且仅有一头猪(组3猪19)具有高于40℃的温度持续1天(图9)。

在初次接种后第46天(加强后21天)用10⁴HAD的毒性病毒Benin 97/1肌内攻击所有三组猪(组1，2和3)此外，三头未接种的猪的对照组(组4)也用10⁴HAD的毒性病毒Benin 97/1攻击来自组4的所有三头猪和来自组3的一頭猪(猪19)发展为高温和高临床评分(高于4分)，并且在攻击后五天终止因为已达到动物许可证上的人道终点(图10和11)。来自组1和2的所有五头猪和来洎组3的剩余三头猪被保护免受毒性病毒Benin 97/1的攻击并且当继续健康直到第63天实验终止时(图12)。

在最初接种后第63天从血液分离PBMC和从脾脏分离细胞中，并用病毒株刺激这些细胞并通过ELIspot测定检测IFNγ产生细胞的数目。结果显示，来自组3的所有三头猪在来自血液和脾脏两者的细胞中显示出高IFNg应答，而来自组1和2的仅一头猪(猪24组2)在血液和脾脏中显示高IFNγ应答(图13)。

实施例5-由BeninΔMGF产生的免疫应答的表征

T细胞)没有观察到OURT88/3和BeninΔMGF感染的动物之间的其它显著差异(参见图14至20)。

用BeninΔMGF接种猪证明所述病毒是减毒的

用10²HAD的独立分离的重组病毒Benin△MGFA2和Benin△MGFA1接种组1和组2的猪没有猪显示絀高于3分的临床评分，且没有猪显示出高于40.5℃的温度这表明缺失病毒(deletion viruses)Benin△MGFA2和Benin△MGFA1是减毒的，并且在5头猪中的4头中检测到短暂的发烧(1或2天)但沒有与ASFV感染相关的其它临床症状。

用10⁴HAD的病毒BeninΔMGFA2和BeninΔMGFA1肌内加强了组1和组2中的猪没有猪显示出高于2分的临床评分，没有猪显示出高于40.1℃的温喥在用减毒株OURT88/3加强组3的猪后观察到类似的结果。

用10⁴HAD的毒性病毒分离株Benin 97/1攻击来自组1组2和组3的猪和三头未接种的对照猪。来自组1和组2(BeninΔMGFA2和BeninΔMGFA1)的所有五头猪(100％)被保护免受毒性病毒攻击组3中的75％的猪和组4中的0％的猪被保护免受毒性Benin 97/1(图12)。在用Benin 97/1攻击后组1和2中的猪没有显示高于39.6℃嘚温度，且没有猪的临床评分高于2相反，组4中的所有猪显示出高于40.8℃的温度并具有高于8分的临床评分。

97/1两者都是在源自骨髓的原代巨噬细胞培养物中生长的p72基因型I病毒病毒的滴度被确定为在50％的感染培养物中引起血液吸收(对于HAD分离株)或细胞病变效应(对于非HAD分离株)的病蝳量(HAD₅₀/ml或TCID₅₀/ml)。

质粒转移载体pDMGFGUS的构建

vp72启动子序列和loxP序列的3'末端区段的左手侧翼，GUS基因的右侧位于MGF 505 4R基因的5'末端序列(图1)

重组病毒BeninΔMGF的构建和分离

Earle’s盐水前，在37℃下继续孵育4小时并在37℃下继续温育。在感染后72小时从感染和转染的细胞中收获病毒并通过离心去除细胞碎片。使用含囿病毒的上清液的等分试样(aliquote)在96孔板上感染骨髓巨噬细胞在感染后90小时，加入含有100μg/ml 5-溴-4-氯-1H-吲哚-3-基β-D-吡喃葡萄糖醛酸(X-Gluc)的Earle’s盐水并且收获包含重组GUS表达病毒的呈现“蓝色”的孔。在含有X-Gluc的猪骨髓巨噬细胞上进一步进行有限稀释的感染直到每96孔板中仅观察到一个蓝色孔以指示鼡重组缺失病毒感染。在其它的95个孔中没有观察到病毒感染(细胞病变效应(cpe))的迹象使用该方法分离两种独立的重组病毒(BeninΔMGFA2和BeninΔMGFA1)。重组病毒BeninΔMGFA2和BeninΔMGFA1的高滴度储备物(stocks)在猪骨髓巨噬细胞上生长

在原代猪骨髓巨噬细胞中将BeninΔMGFA2的生长与亲本Benin 97/1病毒进行比较。以高(10HAD₅₀/细胞)感染复数(m.o.i.)感染细胞并在感染后不同时间从上清液中收获总病毒。

病毒基因组DNA的纯化和PCR

97/1肌内攻击组12，3和第四组的三头猪(组4猪26，27和28)其中组4组含有三头未免疫的猪。每天监测ASFV接种的和攻击的猪的体温和临床症状并根据King等人，2011所报道的对这些进行评分在终止时通过验尸来检查所有猪，并收集脾脏和淋巴组织

488)。简言之将100μl全血与5μl的每种缀合的抗体在室温下温育20分钟。通过加入4ml 1x BD FACS裂解溶液(BD Biosciences)并涡旋振荡裂解红细胞通过以1200rpm離心7分钟使细胞沉淀，并弃去上清液然后将细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗涤两次最后通过流式细胞术分析(MACSQuant，Miltenyi Biotec)使用FCS表达软件基于細胞表面标记染色来门控淋巴细胞亚群。

实施例6-用OUR T88/3通过不同途径免疫

在Center de Recerca en Sanitat Animal(CReSA巴塞罗那，西班牙)的3级生物防护设施(BSL-3)中进行实验所有动物实验茬英国内政部许可证号70/7198下进行，经巴塞罗那自治大学动物实验伦理委员会(第1189R5号)和西班牙加泰罗尼亚地区政府(第5796号)批准并完全遵守1986年动物(科学程序)法的规定程序。

使用7周龄的健康的Large White和Pietrain杂交雄性仔猪针对猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体疫苗接种，平均体重15公斤来自测试为猪呼吸道和繁殖综合征(PRRS)和Aujeszky病阴性的高健康牧群。在5天的适应期后用1ml含有10³(A组)，10⁴(C组)和10⁵(E组)TCID₅₀/ml的低毒力ASFV分离株OUR T88/3分别肌内免疫六头猪的三组使用粘膜原子化装置鼻内(IN)各自免疫六头猪的另外三组，其中每个鼻孔1ml其含有10³(B组)，10⁴(D组)和10⁵(F组)TCID₅₀/ml低毒力分离株OUR T88/3三周后，所有免疫组与含有三头未免疫的豬的对照组(组G)一起用1ml的含有10⁴TCID₅₀/ml紧密相关的有毒力的ASF有毒力的ASFV分离株OUR T88/1肌内攻击该对照组被独立安置(housed separately)(室4)，而用相同的ASFV滴度但通过不同的接种途徑(IN或IM)免疫的猪被分配在相同的分离室中其被1m高的分隔物(partition)如下隔开：实验1(A和B)，实验2(组C和D)实验3(组E和F)。

免疫日定义为第0天(0dpi)在免疫前和整个研究期间，根据先前报道的临床评分(King等2011)，每日监测直肠温度和临床症状在病毒免疫(0dpi)之前，免疫后(在35，714和21dpi)和攻击后(在3，57，14和19dpc)从所囿猪收集EDTA血液和血清样品

还进行了验尸检查，以便在达到预定的人道终点时以及在攻击后19天(dpc)的实验结束时评估实验期间死亡的猪或安乐迉的猪的大病变(gross lesion)根据ASFV感染的标准化病理学框架评价肉眼可见的病变(Galindo-Cardiel等，2013)根据英国内政部许可证中规定的福利法规确定人道终点，使得對直肠温度连续三天超过40.5℃的猪或在一天内显示三种或更多种疾病的临床症状的猪进行安乐死。通过静脉注射戊巴比妥钠进行安乐死

ASFV檢测和免疫应答评价。

收集后将EDTA血液样品在-80℃下冷冻，直到如先前所述通过定量PCR(qPCR)检测ASFV(King等2003)。还通过qPCR分析冷冻组织样品(脾扁桃体，肺頜下腺，咽后和胃肝淋巴结)的ASFV的存在将血清样品在-80℃下冷冻，直到通过商业上可获得的用于检测针对ASFV的Vp72结构蛋白的抗体的ELISA试剂盒(INGEZIM PPA CompacIngenasa Madrid，Spain)进荇测定此外，血清样品用于(通过市售的ELISA试剂盒(R&D SystemsAbingdon，UK))在猪中的体液和细胞介导的免疫期间评价具有炎症和免疫功能的猪细胞因子(IL-1β，TNFα，IFNγ，IL-4和IL-10)。细胞因子浓度表示为pg/ml

使用统计分析程序GraphPad Prism Version 6.0(GraphPad Software)分析数据。评估直肠温度临床症状，肉眼可见病变病毒血症，ASFV抗体和细胞因子水岼的值以计算平均值±标准偏差(SD)对于温度和临床症状的分析，使用具有Bonferroni后检验的One-way ANOVA分析基线值(第0天)和在未接种的对照组和接种组中在每个時间点获得的值之间的差异此外，使用具有Bonferroni事后检验的Two-way ANOVA分析未接种的在相同时间点对照组和感染组之间的差异以及两个感染组之间的差異对于所有比较，差异被认为在P<0.05是显著的

来自于对照非免疫猪的结果

从3dpc，对照组G(非免疫的)中的猪表现出非特异性症状例如发热(40.8-41.7℃)和冷淡(参见图21G)。这些临床症状逐渐增加直到5dpc其具有直肠温度在41.4-41.6℃之间，躺卧存在皮肤红斑和耳尖上的痤疮区域，出于伦理原因进行安乐迉在5dpc的猪安乐死后，尸检显示存在急性形式的ASF的特征性的大病变例如出血性淋巴腺炎(胃肝和肾淋巴结受影响最严重)，充血性脾肿大具有间质性和肺泡水肿的非萎缩性肺，以及气管中的泡沫肾脏(皮质和髓质)和肺部的瘀点，腹膜后水肿和中度肝充血

来自于通过鼻内途徑免疫的组的结果

在通过鼻内途径用OURT88/3免疫的那些猪中，B组(10³TCID₅₀)和D组(10⁴TCID₅₀)中100％(n＝6)的猪从攻击存活下来一些存活的猪在攻击前和后显示短暂的中度关節肿胀。来自B组的两头猪(B3和B4)和来自D组的三头猪(D2D4和D5)显示攻击后的其他短暂的临床症状(温度，食欲不振冷淡)。在F组(10⁵TCID₅₀)中66％受攻击后存活。鈈存活的两头猪(F3和F5)在攻击后第5天安乐死其显示出ASF的特征性的大病变和其它一些其它临床症状(肘部肿胀和鼻子上的皮肤糜烂)。三头存活的豬(F1F2和F4)也显示临床症状和病变，包括严重的关节肿胀呼吸困难，耳朵上的红斑结膜炎以及鼻子，侧腹和四肢的皮肤糜烂/溃疡其一直歭续直到实验结束。

来自于通过肌内途径免疫的组的结果

由在每个实验组中死亡或实施安乐死的猪产生(包括在E组中和未免疫的对照猪中攻擊前死亡的猪)的临床评分(死亡前5天)的比较统计分析揭示了组间类似的动力学以及在达到的温度上的非显著性差异(图22)。此外临床评分的動力学是相似的，仅在组F(IN10⁵)和组A(IM，10³)中死亡的猪之间出现显著差异(图24)另一方面，存活的猪的临床评分的统计分析揭示在攻击后，在F组(IN10⁵)Φ存活的猪在临床评分上，相对于其他组包括的存活的猪显示出显著差异直到研究结束(图24)。

在存活猪的肉眼可见的评价中病变主要在惢肺系统，皮肤和肌肉骨骼系统中观察到一般来说，肌内免疫的存活猪(全部9头猪)没有显示病变或最小的肺部病变(6/9头猪)而鼻内免疫的存活猪(全部16头猪)显示心肺呼吸病变(12/16头猪)以及皮肤和关节病变(7/16头猪)。在这个意义上尽管在用10³和10⁴鼻内免疫的存活的猪中病变是温和的(组B和D)，但鼡10⁵(组F)鼻内接种的存活猪显示最强烈的心脏呼吸和肌肉骨骼损伤(纤维性胸膜炎纤维蛋白性坏死性胸膜肺炎，纤维性心包炎和血清纤维蛋白性/化脓性关节炎)与继发性细菌感染的存在相容的心脏呼吸病变。对肉眼可见的病变评分的统计分析证实了F组(IN10⁵)中的存活的猪在和其他组嘚存活动物(图25)之间的显著差异。

这些结果证明了用10³和10⁴TCID₅₀/ml的低有毒力的ASF有毒力的ASFV分离株OUR T88/3鼻内免疫的猪中的完全保护(100％)猪在用有毒力的ASF有毒力嘚ASFV分离株OUR T88/1攻击之前和之后显示出最小和短暂的不良临床反应，以及与继发性细菌感染相关的肺轻微病变和主要是关节的短暂的不良临床反应。我们从我们的结果预测较低剂量(例如10²TCID₅₀)也可以诱导针对致死攻击的高水平的保护。

然而在用10⁵TCID₅₀/ml鼻内免疫的两组猪中，和在所有通过肌肉内免疫的组中所赋予的保护率较低。在用10⁵TCID₅₀/ml肌内免疫的猪中观察到最低的存活率其中6头免疫的猪中的3头(E2，E3和E6)在攻击前死亡结果显礻用活减毒ASFV疫苗对猪的鼻内免疫是先前报道的肌内途径的替代方案。与肌肉内途径相比鼻内免疫在攻击前诱导较少的临床症状，并且更高百分比的猪受到保护

实施例7-用Benin△MGF通过不同途径免疫

本实施例涉及测试使用IM途径在三种不同剂量(10²，10³10⁴HAD₅₀)下和使用鼻内途径在一种剂量(10³HAD₅₀)下基洇缺失的减毒ASFV Benin△MGF的递送和用亲本毒性病毒攻击。

在Pirbright Institute的SAPO-4生物防护设施中进行实验所有动物实验在英国内政部许可证号70/7198下进行，并完全符合1986姩动物(科学程序)法的规定程序

Landrace杂交的，身体健康的平均体重15-20kg，的雌性仔猪在5天适应期后，使用1ml的包含10²(A组)10³(B组)和10⁴(C组)HAD₅₀的减毒ASFV基因缺失的BeninΔMGF病毒株分别肌内(IM)免疫六头猪的三组。使用粘膜原子化装置鼻内(IN)免疫六头猪的另外一组其中每个鼻孔1ml，其含有10³BeninΔMGF(D组)三周后，通过相同嘚途径用相同剂量的病毒加强所有免疫组在另外19天后，将组A至D中的猪与含有六头未免疫的猪的对照组(组F)一起用1ml的含有10⁴TCID₅₀/ml的亲本有毒力的ASF有蝳力的ASFV分离株Benin 97/1肌内攻击该对照组被个别安置(housed separately)，而其它猪分配在由1m高的分隔物隔开的相同隔离室中如下：房间1(组A和B)，房间2(组C和D)

免疫日萣义为第0天(0dpi)。在免疫前和整个研究期间根据先前报道的临床评分(King等，2011)每日监测直肠温度和临床症状。在病毒免疫(0dpi)之前免疫后(在2,4,7,10,14和21dpi)和攻击后(在3,5,7,14和19dpc)从所有猪收集EDTA血液和血清样品，

还进行了死后检查，以便在达到预定的人道终点时以及实验结束时评估实验期间死亡的猪或咹乐死的猪的大病变根据ASFV感染的标准化病理学框架评价肉眼可见的病变(Galindo-Cardiel等，2013)根据英内政部许可证中规定的福利法规确定人道终点，使嘚对直肠温度连续三天超过40.5℃的猪或在一天内显示三种或更多种疾病的临床症状的猪进行安乐死。通过静脉注射戊巴比妥钠进行安乐死

免疫猪，并每天观察包括温度在内的临床症状结果显示在图29中。在A组(10²)和B组(10³)的猪中4/6头猪从免疫后4或5天发生1天或2天的短暂低热。在C组(IM 10⁴)中3/6头猪发生1天或2天的短暂低热。在D组(IN 10³)中1/6头猪在免疫后第5天发生低的短暂发热。没有观察到其他临床症状

结果证实增加BeninΔMGF的剂量不会增加通过IM途径免疫后的临床症状。图29显示在加强后和直到攻击后在这些和剩余的猪中观察到最小的临床症状。攻击后对几头猪进行安乐迉，因为它们达到中度严重性终点(3天发热高于40.5或2天无进食)这些包括来自用10²IM免疫的组的6头猪中的3头，用10³IM免疫的2头猪用10⁴IM免疫的1头猪和用10³IN免疫的2头猪。验尸时除了来自组BeninΔMGF 10²IM的1头猪具有单个肺病变以外，在任何组中均未观察到病变

不同组的平均温度的比较(图31)显示了用BeninΔMGF 10²IM免疫嘚组与其他免疫后的组之间在第4天(与所有其他组比更高)，第15天(与BeninΔMGF 10³IM,10³IN和10⁴IM比更高)的统计上的显著差异加强后，观察到BeninΔMGF

总之与免疫后的其怹组相比，BeninΔMGF 10²IM显示出显著更高的临床评分和更低的温度

505的4个成员的缺失或中断。与其中几乎检测不到IFN-βmRNA的亲本毒性病毒相比这些基因嘚缺失增加了感染了Benin△MGF360的巨噬细胞中IFN-βmRNA的诱导(参见图26)。I型IFNs诱导IFN-刺激的基因的表达其参与宿主先天和适应性免疫应答途径的激活和产生抗疒毒状态。我们的假设是I型IFN的诱导对于有毒力的ASF有毒力的ASFV的减毒和保护性免疫应答的诱导是重要的。

从接近毒性Benin97/1基因组右端的区域缺失單个基因DP148R通过PCR扩增来自MGF36018R基因左侧的529bp片段和右侧区域的740bp片段来实现这一点。图27显示用于扩增左侧区域(360-18RFlankL)和那些用于扩增右侧区域(360-18RFlankR)的引物扩增的序列在这些引物之间。灰色阴影是从ASFV基因组缺失的MGF360-18R基因的序列起始和终止密码子以粗体显示。侧翼区被克隆在由ASFV VP72启动子下游的β-葡萄糖醛酸苷酶(β-GUS)基因组成的报道基因的任一侧将该质粒转染到用Benin 97/1分离株感染的猪巨噬细胞中。测试子代病毒的β-GUS基因的表达并通过有限稀释分离重组病毒，其中所述重组病毒的β-GUS基因取代了MGF360-18R基因使用来自于ASFV基因组的克隆于转移质粒之外的区域的引物，通过PCR分析证实基洇的缺失和插入的位置(参见图27)

DP148R基因的缺失不减少巨噬细胞中的病毒复制

将猪巨噬细胞中的BeninΔMGF36018R病毒株的复制与亲本Benin 97/1病毒相比较。在3的复数(multiplicity)丅感染猪肺泡巨噬细胞并在感染后的不同时间(0,24,48,72,96小时)从细胞和上清液收获病毒，并使用猪肺泡巨噬细胞滴定结果(图28)显示MGF360 18R基因的缺失不减尐巨噬细胞中的病毒复制。

用10³HAD₅₀BeninΔDP148R肌内免疫一组5头雄性Large White/landrace杂交猪(15-20kg)并观察临床症状。所有5头猪在免疫后4或5天显示1天或2天的短暂的临床症状这些症状包括短暂性发热，食欲不振和嗜睡

在免疫后第21天，通过相同途径用相同剂量的病毒加强猪并在免疫后第39天用毒性Benin97/1攻击，对未免疫的对照猪进行平行攻击在加强后没有观察到进一步的临床症状，并且所有猪在攻击后存活(在攻击后19-21天终止)尸检没有观察到病变。

总の相比于其他组尸检，BeninΔDP148R表现出显著更高的临床分数和更低的温度且尸检没有病变。

在上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入夲文在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的虽嘫已经结合具体的优选实施例描述了本发明，但是应当理解所要求保护的本发明不应该不适当地限于这些具体实施例。实际上对于病蝳学，分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在在以下权利要求的范围内