推广阻力众多，发酵菌剂市场开发不到10%

《农财宝典》新牧网 记者 叶嘉宏 16:00:04

近几年，产品同质化、饲料原料紧缺、价格普涨、食品安全受到威胁、环境污染日趋严重等一个个压力，可谓是考验着行业中各个企业的每一根神经。为了有效缓解原料紧缺、健康养殖、环境污染等公共问题，许多企业纷纷把目光投放到发酵饲料上。业内人士表示，影响发酵饲料品质的关键点除了发酵工艺以外，就是发酵菌剂了。

30多种菌株允许用于生产，液体菌剂活性好于固体菌剂

实际上，能作发酵用的微生物菌种有很多，据农业农村部公布的饲用微生物菌种目录就有七大类，分别是：乳酸菌类、双歧杆菌类、芽孢杆菌类、酵母类、霉菌类、光合细菌类和丙酸杆菌类，而在实际生产中使用，最多的无外乎乳酸菌类、芽孢杆菌类和酵母类。三类菌种的特性都有所不同。

不过，同一菌种下却是有许多不同的菌株，这些菌种在功能特性和环境适应性方面都不尽相同。据宜春强微生物科技有限公司董事长（下面简称“强微”）钟启平透露，目前国家允许使用的微生物菌株大约有30多种，但是他相信，随着技术的进步，未来将会不断有新的菌株进入目录。

与直接饲用的微生物菌剂不同，发酵菌剂并不以有效活菌数作为评判标准，而是以发酵活性作为参考指标，所谓的发酵活性就是菌剂易活化，接种至发酵原料中生长迅速，对原料的转化速度快，各项发酵指标适宜。如果按照其活性来进行分类，可分为新鲜发酵饲料用接种剂和烘干发酵饲料用接种剂。

据生物饲料开发国家工程中心主任蔡辉益介绍，用作制作发酵饲料的发酵菌剂一般可分为液体菌剂和固体菌剂两种，前者一般为新鲜制备的发酵液，其发酵活性要好于固体菌剂，但需配备液体发酵设备，前期投入较大；而固体菌剂的优势则在于其使用、保存较为方便，对设备的要求不高，但在原料混合前需对菌剂进行活化。

据山东宝来利来生物工程股份有限公司技术总监李传友透露，发酵饲料多采用固态发酵，目前也有液态发酵来做液体饲料。基于两种菌剂的特性，一般液体菌剂更多地应用于生产发酵饲料、发酵原料的企业，而固体菌剂更多应用于大规模猪场。
复合菌+复合酶制剂的发酵菌剂效果更佳

“微生物发酵的关键是菌种菌株。”李传友表示，发酵饲料需要根据发酵原料、发酵目的进行发酵菌种、菌株的筛分以及对工艺等进行分析。对此，钟启平也表示赞同，同时他也举出了几个对应的例子：如青贮是以戊糖片球菌和乳酸片球菌为主；发酵食品下脚料糟渣的发酵则以酵母菌和复合酶制剂为主；若是发酵全价饲料便是以乳酸菌为主……

在李传友看来，虽然微生物发酵技术相对而言比较简单，但是对于不同菌种、不同底物、不同条件的筛选和优化是困扰众多发酵企业生产的一大难点。特别是菌株，即便是同一菌种，不同的菌株发酵后在作用与应用工艺上也会有极大的不同，而这也要求企业需要对菌株进行仔细地筛选。据悉，筛选到一株具有特定功能的菌株，至少需要5年的时间，期间还需要经过大量的验证，不是随便就能应用到生产中。

钟启平告诉记者，由于单一菌剂的发酵效果并不理想，因此在通常情况下，企业通过把同一类菌种不同菌株，或者不同类菌种进行组合使用，才能够达成对于一些目标饲料进行发酵酶解的目的。但是，不同菌种之间的配合并不是都能发挥1+1=2效果，更多的可能是会出现1+1＜2的情况，因此在实际应用中，发酵菌剂更多的是以复合菌+复合酶制剂的形式出现。

而之所以需要这样的配伍使用，是因为发酵饲料一般是通过厌氧发酵的方式进行生产，在厌氧发酵的条件下，菌种的产酶功能很弱，因此需要额外添加复合的酶制剂如非淀粉多糖酶，纤维素酶等来帮助发酵。复合酶制剂为可对发酵物料的植物细胞壁进行破壁方便微生物细胞渗透发酵，使植物原料结构疏松，分解大分子的有机物质，为微生物提供更多的可利用的小分子营养。因此，复合菌和复合酶制剂的配伍使用能够带来更好的协同效果。“菌的科学搭配也可以减少活菌含量，而达到同样好的发酵效果”钟启平如是认为。

除了要选择合适的发酵菌剂以外，发酵菌剂的添加量也是有学问的。李传友告诉记者，发酵菌种的添加量是根据菌种的状态和发酵的季节来定的，一般来说，新鲜的液态菌种相对来说接种比例比固体的低一点；温度高的季节会比温度低的季节接种比例低一点。

“发酵菌剂产品的添加量与产品的活菌含量，酶制剂活性有关”钟启平补充道，含活菌量和酶活力越高的产品，所需要的添加量自然就更少。他认为，要想发酵饲料的效果最佳化，一般要求被发酵物料中的活菌含量至少在100万活菌/克原料以上，且必须配合复合酶制剂搭配使用；这相当于含菌量100亿/克的发酵菌剂产品至少添加量为100克/吨被发酵物料。
发酵菌剂需注意阴凉干燥通风处保存

实际上，发酵菌剂是相当娇养的，如果不注意保存，其有效活菌数就会损失，在实际应用中效果就会大打折扣，或者导致增加添加剂量。钟启平表示，对于发酵菌剂产品的日常保存，首先最重要的是干燥，其次是注意温度，最后是要注意通风。

据他透露，如果保存环境过于潮湿，活菌的损失是最大的。强微曾经就做过一个实验：在10℃的低温地下室潮湿环境中保存含水量20%的菌剂产品，可在一个月内损失活菌80%以上，但在35℃的放置了干燥剂密封玻璃罐中保存含水量5%以内的菌剂产品，放置一个月基本没有损失。因此，他建议猪场老板在使用这类产品时，在常规的保存中要注重保证环境的干燥，然后保持温度低于30℃，还要避免阳光直射。

目前，市面上的菌剂产品琳琅满目，再加上发酵菌剂也不像饲料、兽药这些产品一样，有相应的行业标准，因此，不少使用者在挑选产品时显得无所适从，不知该如何评估判断发酵菌剂产品的好坏。

记者从钟启平处了解到，许多该类产品的使用者受设备等条件限制，所以一般来说，他们对发酵菌剂品质的判断是通过最基本的感官判断，如气味、产气速度、甚至PH值等的初浅认识上。但实际上，他们的一些认识是存在误区的。如产气速度，产气越快（主要是二氧化碳），只能说明发酵消耗的能量越多，后期进入厌氧阶段后，产气自然就停止了，不仅如此，一些用塑料袋子装料发酵的（呼吸膜袋子中发酵）最终还会吸气，造成发酵袋呈现真空包装状态；而PH值的下降，是发酵产酸的结果，一些含能量高（淀粉质，糖份）的原料PH自然下降最快，而能量少的原料则PH下降要慢得多……而这些都不足以成为判断的标准和依据。

为此，钟启平为没有测试条件的用户提供了一个判断发酵菌剂品质好坏的操作方法：取1克发酵菌剂，加50克大米，加150毫升水，置于矿泉水瓶中，盖子不要完全盖住（因为产气会膨胀），在25℃以上环境中放置发酵，每天摇晃2-3次，一般发酵1-2天后，PH降为2-4之间，大米会完全溶解成乳状或细砂状(如图右侧)，闻一下感觉气味是醇香酸香味的，喝一口，口感是醇和；如果是不太好的菌剂，则完全不能把大米分解成乳状或细砂状(如图左侧)，甚至发酵一个月也没有变化，气味、口感都不协调。

发酵菌剂处于市场规模大，份额小的尴尬局面

近年来，在养殖禁抗、减抗趋势越发明朗的情况下，越来越多企业把精力投放到新型、绿色、环保的生物饲料产品的研发中。而在养殖业逐渐步入无抗、禁抗养殖的变革浪潮中，从事微生态制剂研究生产的企业也像雨后春笋般地渐渐多了起来。

据钟启平估算，全国用于发酵饲料及发酵豆粕的发酵菌剂市场规模在15亿元左右；发酵食品下脚料和屠宰下脚料，发酵厨余等下脚料的发酵菌剂市场规模估计在40亿元左右；如果秸秆黄贮也算在内则市场规模可再增加30亿元，若再加上青贮则再增加40亿元以上……通过这些折合估算，发酵菌剂的市场规模可以在125亿元。

但是，无论是钟启平还是李传友都表示，发酵菌剂市场目前仅开发不到10%的比例。另外，发酵菌剂市场中，有不少的市场份额被像宝来利来、强微、广州博善生物科技有限公司、青岛蔚蓝生物股份有限公司这些老牌微生态制剂企业所占据。单以发酵菌剂来计算，它们有的甚至一年能做到3000万的销售额。

之所以发酵菌剂处于市场规模很大、但份额很小这样尴尬的局面，原因有多方面。首先，对于发酵菌剂的好坏评定乃至发酵饲料的评定，行业内暂时还没有一个统一的标准，不过目前有一些行业组织如生物饲料开发国家工程研究中心，就在积极地组织建立相应的团体标准，随着慢慢地完善优化，未来发酵菌剂行业还是有望出台相应的行业标准的。

另一位行业人士认为发酵菌剂不被重视，也是制约其发展的重要原因之一。据悉，比起发酵菌剂，行业中的大企业、大集团更愿意花资金、资源和时间去研发发酵豆粕一类的大型项目，因为像这类的产品更容易上量，且资金流更大。而对于使用者来说，以前有很多人会选择把上次使用剩下的发酵菌剂留下一些做引子，下次接着用，甚至自己进行扩培使用，发酵菌剂产品销量因而受到限制。

而发酵菌剂的推广还受限于发酵饲料的应用普及。虽然目前生物饲料的应用比起以往有了不少的提升，但据记者了解，目前使用发酵饲料的群体中，中小型养殖户占了大部分的比例，不少大规模养殖场仍然嫌麻烦。因为发酵饲料是湿料，在饲喂过程中，遇到自动料线便难以应用，如果要应用便会给猪场增加不少的麻烦和劳动强度，这就使得不少大型养殖场“心动却不敢行动”了。

此外，和直接饲用菌剂相比，发酵菌剂的使用专业性要求较高。记者在江西一线走访时，一个存栏母猪上千头的规模猪场老板就表示，发酵饲料对发酵菌剂、发酵温度、发酵工艺等有着十分高的要求，因此猪场还需要配备专门、专业的人员去进行发酵饲料的制作，而直接饲用菌剂直接加入饲粮中饲喂就可以了，相比之下更加方便，因此他最后放弃了使用发酵饲料。

再者，如李传友所说的，行业中菌种乱象、过度宣传、夸大使用效果等现象并不少见，临床应用中效果没有达到预期，久而久之，终端市场也开始对产品产生了怀疑，给企业的推广增添了不少的阻力。
（本文刊载于《农财宝典》畜牧版2018年7月刊，P38-40。）

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棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用

本发明属于微生物和生物防治领域，尤其涉及棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。

烟草、苹果均是我国重要的经济作物，其产量及质量关系着种植户的切身利益。高品质烟草对产区的土壤及环境条件有一定的要求，因此烟草连作的现象普遍发生。连作后病害加重、产量下降。近年来苹果枝干病害发生严重，苹果腐烂病和苹果轮纹病联合侵染，逐年加重。目前，控制烟草、苹果病害的一般方法是使用化学农药；然而，长期使用化学农药会导致病原菌产生抗药性而降低化学药剂的防病效果，同时会造成农药残留超标和环境污染。因此，生产中急需一种有效、安全、环保的控制烟草病害新技术；生物防治是利用生防菌与植物病原微生物之间的拮抗作用，抑制引起作物病害的病原菌的生长，是控制植物病害的一种新途径。

针对现有技术中化学农药防治造成环境污染、烟草连作病害发生严重和苹果枝干病害逐年严重等问题，本发明的目的是提供了一株棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。本发明所述棘孢木霉菌TD3104自土壤中分离获得。使用本发明所述生防菌防治烟草、苹果病害，可以减少化学农药的用量及其在土壤中的累积，防止环境污染，有利于提高作物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一株棘孢木霉菌TD3104，其分类命名为棘孢木霉菌Trichodemaasperellum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是：CGMCC 13161。

进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104的菌落白色，质地絮状，有同心轮纹结构，分生孢子梗对生，主分支呈树状；瓶梗短，呈旋涡状排列、安瓿形，基本变细，中间膨大，底部瓶梗较顶部长，分生孢子白色，球形或卵形。

本发明还提供了所述的棘孢木霉菌TD3104在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。

进一步的：所述植物为烟草和苹果。

进一步的：所述病原菌包括：烟草黑胫病菌、立枯丝核菌、烟草青枯病菌、烟草根腐病病原菌镰刀菌、烟草赤星病菌、苹果腐烂病菌和苹果轮纹病菌。

进一步的：所述棘孢木霉菌对病原菌的拮抗机制是重寄生作用、竞争作用和抗生作用。

进一步的：所述菌剂中棘孢木霉菌TD3104有效活菌为1×108～1×109cfu/克。

进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104对烟草病原菌的抑制率在52.1％-100％。

进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104对苹果病原菌的抑制率在60.7％-100％。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明提供的拮抗菌棘孢木霉菌TD3104是发明人自土壤分离的优良生防菌株，对烟草多种病原及苹果主要枝干病害均有较好的抑制作用，抗病性广谱，抗病性表现为营养竞争、寄生、代谢产物拮抗等多种方式。能有效抑制烟草黑胫病菌、立枯丝核菌、烟草青枯病菌、烟草根腐病病原菌镰刀菌、烟草赤星病、苹果腐烂病和苹果轮纹病等病原菌的生长，使用以拮抗菌为有效成分的复合菌剂可以有效防治烟草病害，并且可以减少化学农药的用量和其在土壤、果树中的累积，对于防止环境及果品污染极为重要，同时，也有利于提高我国烟草、苹果等作物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。

图1表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草黑胫病的抑制作用(左图为培养3天，右图为培养15天)。

图2表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对立枯丝核菌的抑制作用(左图为培养3天，右图为培养15天)。

图3表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草根腐镰刀菌的抑制作用(左图为培养5天，右图为培养15天)。

图4表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草赤星病菌的抑制作用(左图为培养5天，右图为培养15天)。

图5表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对苹果腐烂病的抑制作用(左图为培养3天，右图为培养10天)。

图6表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对苹果轮纹病的抑制作用(左图为培养5天，右图为培养10天)。

图7表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草青枯病的抑制作用(培养2天)。

图8表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对苹果枝干病害病原菌菌丝的作用(A:正常苹果腐烂病病原菌菌丝，B：拮抗菌处理的苹果腐烂病病原菌菌丝，C：正常苹果轮纹病病病原菌菌丝，D：拮抗菌处理的苹果轮纹病病原菌菌丝)。

图9表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草黑胫病的抑制作用(A:对照烟苗基部病症；B：对照烟苗病茎纵刨面)。

图10表明不同含量棘孢木霉菌TD3104发酵液对苹果腐烂病菌的抑菌率。

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1：拮抗菌的分离

采用土壤稀释分离法对玉米根围土壤进行分离，本发明所述棘孢木霉菌TD3104即是从此土壤中分离得到，通过将分离物单孢纯化，分别与常见烟草病原菌在PDA平板上两点对峙接种，进行平板拮抗试验，最终筛选得到。

实施例2、拮抗菌的鉴定

1、拮抗菌的形态学鉴定

(1)马铃薯—葡萄糖琼脂(PDA)：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，煮沸10min，纱布过滤，滤液加20g琼脂、20g葡萄糖，再加热使其熔化，最后定容到1000mL，121℃灭菌20min。

(3)LB固体培养基：在LB培养基中加入20g/L的琼脂。

(5)马铃薯—葡萄糖(PD)：PDA去掉琼脂。

将筛选到的菌株接种到PDA平板上，置于28℃恒温恒湿培养箱中倒置培养，观察菌株生长情况。菌落形态为：菌落白色，质地絮状，有同心轮纹结构，生长快速，培养48h后菌落直径达70mm左右，并产生大量白色孢子；分生孢子簇呈半球状，排列为同心轮纹，分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，顶端具有2个或多个瓶梗，主轴顶端下面生出的初次分枝呈对生，与主轴的夹角近90度，主分支呈树状；瓶梗直，呈旋涡状排列、安瓿形，中间膨大，底部瓶梗较顶部长，分生孢子白色，球形或卵球形。

本发明经试验证明棘孢木霉菌TD3104能够产生几丁质酶、纤维素酶和木聚糖酶。

2、拮抗菌的ITS序列鉴定

本实例根据拮抗菌的ITS序列来对其进行分子鉴定。采用CTAB法提取菌株的基因组DNA。以菌株的基因组DNA为模板，ITS1:(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物扩增菌株的ITS序列。扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化后，连接转化，选取阳性克隆送往北京诺赛基因公司进行测序。通过与GenBank中已有的ITS序列进行Blast相似性比较确定菌株的种类。结合菌株的形态学特征和ITS比对结果，最终将菌株确定为棘孢木霉菌Trichodema

将筛选到的棘孢木霉菌TD3104菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年10月17日；棘孢木霉Trichodema asperellum的保藏编号为：CGMCCNo.13161。

实施例3、棘孢木霉菌TD3104的抑菌谱

1、对病原真菌的拮抗性

将棘孢木霉菌TD3104分别与烟草黑胫病菌、立枯丝核菌、烟草根腐镰刀病菌、烟草赤星病、苹果腐烂病和苹果轮纹病等病原真菌采用两点对峙的方法接种到PDA平板上，同时以不接棘孢木霉菌TD3104各病原菌的PDA平板为对照。置于28℃恒温恒湿培养箱中培养，接种3天后观察病原菌落生长情况，当病原与拮抗菌接触时，测量病原菌落半径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100。

表1棘孢木霉菌TD3104对几种真菌病原菌的拮抗性

当培养第4天时，拮抗菌TD3104与病原菌之间有明显的拮抗带，并且拮抗菌的气生菌丝已与病原菌接触，抑菌率在85.7～52.1之间。其中对烟草根腐镰刀菌的抑菌率最高为86.4％，其次为对烟草黑胫病的抑菌率为85.7％(见表1)；继续培养拮抗菌逐步蔓延到病原菌菌落上，最后全部覆盖病原菌菌落，病原菌菌丝逐步消解，抑菌率达100％(见附图1-6)。说明拮抗菌对6种真菌病害具有很强的抑制性。

2、对病原细菌的拮抗性

将烟草青枯病菌接种于LB培养基中，过夜培养，使OD600≥1.0。按1:10加入到LB固体培养基中，制成含菌平板，将拮抗菌的菌饼放置在平板中央，对照不接种拮抗菌。

结果表明拮抗菌TD3104对烟草青枯病具有明显的拮抗性，D/d(透明圈之间/菌落直径)为1.4(见附图7)。

当棘孢木霉菌与各病原菌相交后，挑取交界处病原菌菌丝在光学显微镜下观察两种菌丝的相互作用。参见附图8。棘孢木霉菌缠绕在病原菌的菌丝上或平行波浪式生长；使病菌菌丝变形、断裂，原生质浓缩、溢出；使菌丝细胞中空变形。

因此，棘孢木霉菌TD3104对上述7种病原菌的拮抗机制主要是重寄生作用、竞争作用和抗生作用。

实施例4、拮抗菌发酵液对病原菌的作用

在PDA斜面上接种棘孢木霉菌，28℃条件下培养5天，制备孢子悬浮液。用移液枪取1mL孢子悬浮液接入装有50mL PD液体培养基三角瓶中，28℃振荡培养4天做为种子。取种子液5mL接入装有100mL PD液体培养基的三角瓶中，28℃条件下振荡培养7天。发酵液用8层纱布过滤，滤液10000r/min离心15分钟，取上清液。一部分用0.22um的细菌过滤器过滤除菌，获得无菌发酵液。另一部分发酵液121℃灭菌30min。

将2种无菌发酵液按1:10加入PDA中，制成含毒平板，在平板中心接种病原菌，对照为不含发酵液的PDA，每处理3次重复。28℃培养3天后观察并记录菌落的长势，直至对照菌落长满平板，测量菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

表2不同处理拮抗菌发酵液对病原菌的抑制作用(抑菌率％)

表2研究结果表明，两种处理方法处理的生防菌TD3104发酵液对烟草黑胫病、烟草根腐镰刀菌和立枯丝核菌等病原均有较强的抑制作用，说明拮抗菌TD3104产生的代谢产物是耐高温的物质。

实施例5、不同含量拮抗菌发酵液对病原菌的拮抗性

将高压灭菌处理的无菌发酵液按表3分别添加到熔化后30mLPDA固体培养基中，制成3个含毒平板。将直径为6mm的苹果腐烂病菌饼菌置于上述平板的中央，28℃的恒温培养，当对照的菌落长满平皿时，计算抑菌率。结果见图10，随着培养基中发酵液的含量的增加，抑菌率随之提高；当含量为2.6％时抑菌率达88.43％，此后抑菌率不再随浓度的增加而显著的提高，曲线趋于平缓增加。

表3不同处理培养基中的发酵液含量

采用同样的方法测定不同处理的生防菌发酵液及其不同含量对病原菌的抑制作用，结果表明(如图10和表2所示)高温和过滤两种处理方法生防菌发酵液均对烟草黑胫病、烟草根腐镰刀菌和立枯丝核菌等病原均有较强的抑制作用，并且随着发酵液用量的增加，对病原菌的抑制作用增强，说明拮抗菌TD3104产生的代谢产物具有耐高温高压特性。

实施例6、菌株制剂的制备

在PDA斜面上接种棘孢木霉菌，28℃条件下培养5天，制备孢子悬浮液。用移液枪取1mL孢子悬浮液接入装有50mL PD液体培养基三角瓶中，28℃振荡培养4天做为种子。

将1000g麸皮加入900mL PD液体培养基中，装入培养袋中高温灭菌1h。按5％接种后，28℃固体发酵7天，血球计数板检测孢子数量，结果为孢子数量为1.28×108个孢子/g；稀释涂布检测结果为1.69×109cfu/g。

实施例7、生防菌的防病性

在90cm燕麦片培养基平板上接种黑胫病病原，28℃条件下培养15天，将菌体连同培养基一起捣碎，备用。

将十字期烟苗移栽到花盆中(盆土经过高温灭菌)，5天后进行试验。处理1：在烟苗周围接种黑胫病病原15g，同时接种拮抗菌15克；处理2：对照只接种病原15g；处理3：另设不接种任何菌株的对照，正常管理。培养35天后，测量各种生物性状，病调查发病率。

结果表明：接种病原的对照发病率为100％(表4)，其根基部有明显的病变，剖开茎部，可以明显看到维管束坏死，重新分离可以得到烟草黑胫病病原菌；未接种病原和同时接种病原接+拮抗菌的处理发病率均为0，植物茎部颜色正常，剖开茎部维管束正常(见图9)。说明拮抗菌具有良好的防病效果。

接种培养35天，各处理烟苗地上部性状表现为叶片数各处理相同，株高、叶绿素、茎粗均为只接种病原菌的处理最小，叶长*叶宽为接种病原并同时接种拮抗菌的处理最大(表5)。

表5各处理烟苗地上部性状

接种培养35天，各处理烟苗根部性状表现为：接种病原并同时接种拮抗菌时根长最大，植株鲜重和根重为只接种病原菌的处理最小，同时接种拮抗菌的处理与未接菌的处理相差不大(表6)。

这说明当病害发生时，一定量的拮抗菌TD3104可以有效抑制病原菌的生长，减轻病原菌对烟草生长的危害。

综上所述，本发明提供的拮抗菌，对多种病原菌有很强的抑制作用，并通过寄生和竞争作用抑制病原菌丝的生长，同时其代谢产物也能有效的抑制病原菌的生长，可用于防治烟草、果树病害。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1：拮抗菌的分离

采用土壤稀释分离法对玉米根围土壤进行分离，本发明所述棘孢木霉菌TD3104即是从此土壤中分离得到，通过将分离物单孢纯化，分别与常见烟草病原菌在PDA平板上两点对峙接种，进行平板拮抗试验，最终筛选得到。

实施例2、拮抗菌的鉴定

1、拮抗菌的形态学鉴定

(1)马铃薯—葡萄糖琼脂(PDA)：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，煮沸10min，纱布过滤，滤液加20g琼脂、20g葡萄糖，再加热使其熔化，最后定容到1000mL，121℃灭菌20min。

(3)LB固体培养基：在LB培养基中加入20g/L的琼脂。

(5)马铃薯—葡萄糖(PD)：PDA去掉琼脂。

将筛选到的菌株接种到PDA平板上，置于28℃恒温恒湿培养箱中倒置培养，观察菌株生长情况。菌落形态为：菌落白色，质地絮状，有同心轮纹结构，生长快速，培养48h后菌落直径达70mm左右，并产生大量白色孢子；分生孢子簇呈半球状，排列为同心轮纹，分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，顶端具有2个或多个瓶梗，主轴顶端下面生出的初次分枝呈对生，与主轴的夹角近90度，主分支呈树状；瓶梗直，呈旋涡状排列、安瓿形，中间膨大，底部瓶梗较顶部长，分生孢子白色，球形或卵球形。

本发明经试验证明棘孢木霉菌TD3104能够产生几丁质酶、纤维素酶和木聚糖酶。

2、拮抗菌的ITS序列鉴定

本实例根据拮抗菌的ITS序列来对其进行分子鉴定。采用CTAB法提取菌株的基因组DNA。以菌株的基因组DNA为模板，ITS1:(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物扩增菌株的ITS序列。扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化后，连接转化，选取阳性克隆送往北京诺赛基因公司进行测序。通过与GenBank中已有的ITS序列进行Blast相似性比较确定菌株的种类。结合菌株的形态学特征和ITS比对结果，最终将菌株确定为棘孢木霉菌Trichodema

将筛选到的棘孢木霉菌TD3104菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年10月17日；棘孢木霉Trichodema asperellum的保藏编号为：CGMCCNo.13161。

实施例3、棘孢木霉菌TD3104的抑菌谱

1、对病原真菌的拮抗性

将棘孢木霉菌TD3104分别与烟草黑胫病菌、立枯丝核菌、烟草根腐镰刀病菌、烟草赤星病、苹果腐烂病和苹果轮纹病等病原真菌采用两点对峙的方法接种到PDA平板上，同时以不接棘孢木霉菌TD3104各病原菌的PDA平板为对照。置于28℃恒温恒湿培养箱中培养，接种3天后观察病原菌落生长情况，当病原与拮抗菌接触时，测量病原菌落半径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100。

表1棘孢木霉菌TD3104对几种真菌病原菌的拮抗性

当培养第4天时，拮抗菌TD3104与病原菌之间有明显的拮抗带，并且拮抗菌的气生菌丝已与病原菌接触，抑菌率在85.7～52.1之间。其中对烟草根腐镰刀菌的抑菌率最高为86.4％，其次为对烟草黑胫病的抑菌率为85.7％(见表1)；继续培养拮抗菌逐步蔓延到病原菌菌落上，最后全部覆盖病原菌菌落，病原菌菌丝逐步消解，抑菌率达100％(见附图1-6)。说明拮抗菌对6种真菌病害具有很强的抑制性。

2、对病原细菌的拮抗性

将烟草青枯病菌接种于LB培养基中，过夜培养，使OD600≥1.0。按1:10加入到LB固体培养基中，制成含菌平板，将拮抗菌的菌饼放置在平板中央，对照不接种拮抗菌。

结果表明拮抗菌TD3104对烟草青枯病具有明显的拮抗性，D/d(透明圈之间/菌落直径)为1.4(见附图7)。

当棘孢木霉菌与各病原菌相交后，挑取交界处病原菌菌丝在光学显微镜下观察两种菌丝的相互作用。参见附图8。棘孢木霉菌缠绕在病原菌的菌丝上或平行波浪式生长；使病菌菌丝变形、断裂，原生质浓缩、溢出；使菌丝细胞中空变形。

因此，棘孢木霉菌TD3104对上述7种病原菌的拮抗机制主要是重寄生作用、竞争作用和抗生作用。

实施例4、拮抗菌发酵液对病原菌的作用

在PDA斜面上接种棘孢木霉菌，28℃条件下培养5天，制备孢子悬浮液。用移液枪取1mL孢子悬浮液接入装有50mL PD液体培养基三角瓶中，28℃振荡培养4天做为种子。取种子液5mL接入装有100mL PD液体培养基的三角瓶中，28℃条件下振荡培养7天。发酵液用8层纱布过滤，滤液10000r/min离心15分钟，取上清液。一部分用0.22um的细菌过滤器过滤除菌，获得无菌发酵液。另一部分发酵液121℃灭菌30min。

将2种无菌发酵液按1:10加入PDA中，制成含毒平板，在平板中心接种病原菌，对照为不含发酵液的PDA，每处理3次重复。28℃培养3天后观察并记录菌落的长势，直至对照菌落长满平板，测量菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

表2不同处理拮抗菌发酵液对病原菌的抑制作用(抑菌率％)

表2研究结果表明，两种处理方法处理的生防菌TD3104发酵液对烟草黑胫病、烟草根腐镰刀菌和立枯丝核菌等病原均有较强的抑制作用，说明拮抗菌TD3104产生的代谢产物是耐高温的物质。

实施例5、不同含量拮抗菌发酵液对病原菌的拮抗性

将高压灭菌处理的无菌发酵液按表3分别添加到熔化后30mLPDA固体培养基中，制成3个含毒平板。将直径为6mm的苹果腐烂病菌饼菌置于上述平板的中央，28℃的恒温培养，当对照的菌落长满平皿时，计算抑菌率。结果见图10，随着培养基中发酵液的含量的增加，抑菌率随之提高；当含量为2.6％时抑菌率达88.43％，此后抑菌率不再随浓度的增加而显著的提高，曲线趋于平缓增加。

表3不同处理培养基中的发酵液含量

采用同样的方法测定不同处理的生防菌发酵液及其不同含量对病原菌的抑制作用，结果表明(如图10和表2所示)高温和过滤两种处理方法生防菌发酵液均对烟草黑胫病、烟草根腐镰刀菌和立枯丝核菌等病原均有较强的抑制作用，并且随着发酵液用量的增加，对病原菌的抑制作用增强，说明拮抗菌TD3104产生的代谢产物具有耐高温高压特性。

实施例6、菌株制剂的制备

在PDA斜面上接种棘孢木霉菌，28℃条件下培养5天，制备孢子悬浮液。用移液枪取1mL孢子悬浮液接入装有50mL PD液体培养基三角瓶中，28℃振荡培养4天做为种子。

将1000g麸皮加入900mL PD液体培养基中，装入培养袋中高温灭菌1h。按5％接种后，28℃固体发酵7天，血球计数板检测孢子数量，结果为孢子数量为1.28×108个孢子/g；稀释涂布检测结果为1.69×109cfu/g。

实施例7、生防菌的防病性

在90cm燕麦片培养基平板上接种黑胫病病原，28℃条件下培养15天，将菌体连同培养基一起捣碎，备用。

将十字期烟苗移栽到花盆中(盆土经过高温灭菌)，5天后进行试验。处理1：在烟苗周围接种黑胫病病原15g，同时接种拮抗菌15克；处理2：对照只接种病原15g；处理3：另设不接种任何菌株的对照，正常管理。培养35天后，测量各种生物性状，病调查发病率。

结果表明：接种病原的对照发病率为100％(表4)，其根基部有明显的病变，剖开茎部，可以明显看到维管束坏死，重新分离可以得到烟草黑胫病病原菌；未接种病原和同时接种病原接+拮抗菌的处理发病率均为0，植物茎部颜色正常，剖开茎部维管束正常(见图9)。说明拮抗菌具有良好的防病效果。

接种培养35天，各处理烟苗地上部性状表现为叶片数各处理相同，株高、叶绿素、茎粗均为只接种病原菌的处理最小，叶长*叶宽为接种病原并同时接种拮抗菌的处理最大(表5)。

表5各处理烟苗地上部性状

接种培养35天，各处理烟苗根部性状表现为：接种病原并同时接种拮抗菌时根长最大，植株鲜重和根重为只接种病原菌的处理最小，同时接种拮抗菌的处理与未接菌的处理相差不大(表6)。

这说明当病害发生时，一定量的拮抗菌TD3104可以有效抑制病原菌的生长，减轻病原菌对烟草生长的危害。

综上所述，本发明提供的拮抗菌，对多种病原菌有很强的抑制作用，并通过寄生和竞争作用抑制病原菌丝的生长，同时其代谢产物也能有效的抑制病原菌的生长，可用于防治烟草、果树病害。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。