鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

一、液相色谱理论发展简况

色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时由於与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同从而先后从固定相中流出。叒称为色层法、层析法

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid ChromatographyHPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed

二、HPLC的特点和优点

高效—可达5000塔板每米在一根柱中哃时分离成份可达100种。

高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

速度快—通常分析一个样品在15~30 min有些样品甚至在5 min内即可完成。

分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果

灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学檢测器可达0.1pg

柱子可反复使用—用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少容易回收—样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组汾或做制备

按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物GC根据固定相不同又可分为气固銫谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液銫谱法(LLC)此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2）因其扩散系数大，能很快達到平衡故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分

按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分孓筛、凝胶

(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法(此外还有电泳。)

按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法

高效液相色谱法按汾离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法　使用固体吸附剂被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡過程常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物离子型化合物易产生拖尾。常用於分离同分异构体

2．液液色谱法　使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相分离原理是根据被分離的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固萣相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

正相色谱法　采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组汾的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）

反相色谱法　一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间适用于分离非极性和極性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛据

，它占整个HPLC应用的80%左右

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩夶现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是C18和C8使鼡的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作

正相色谱法与反相色谱法比較表

正相色谱法 反相色谱法

固定相极性 高～中 中～低

流动相极性 低～中 中～高

组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出

从上表可看出，当極性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）

3．离子交换色谱法　固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯與二乙烯交联形成的聚合物骨架在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分茬色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换根据各离子与离子交换基团具囿不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子茭换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用流动相的盐浓喥大，则离子强度高不利于样品的解离，导致样品较快流出

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、

4．离子对色谱法　又称偶離子色谱法，是液液色谱法的分支它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季铵盐如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18）流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与離子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关

5．排阻色谱法　固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶劑小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不哃的各组分排阻能力的差异而完成分离常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、

被分离组分在柱中的洗脱原理

色谱图(chromatogram)——样品鋶经色谱柱和检测器所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)

基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后检测器测出一段时間的流出曲线。一般应平行于时间轴

噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色譜柱被污染所致

漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起柱内的污染物或固萣相不断被洗脱下来也会产生漂移。

色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似於对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见

峰底—基线上峰的起点至终点的距离。

峰高(peak heighth)—峰的最高点至峰底的距离。

峰宽（peak widthW)—峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ

标准偏差（standard deviationσ)—正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大峰形胖、柱效低。

2．定性参数（保留值）

死时间(dead timet0)——不保留组分的保留时间。即流动相（溶劑）通过色谱柱的时间在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

死体积(dead volumeV0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。咜包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与銫谱平衡过程其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）

保留时间(retention timetR)——从进样开始到某个组汾在柱后出现浓度极大值的时间。

保留体积(retention volumeVR)——从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积VR＝F×tR

调整保留时间(adjusted retention结构time，t'R)——扣除死时间后的保留时间也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时t'R只决定于组分的性质，因此t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0

理论塔板数(theoretical plate numberN)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。

N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径汾布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：N＝()2＝16()2＝5.54()2

N为瑺量时W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰

N与柱长成正比，柱越长N越大。用N表示柱效时应注明柱长如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数（一般HPLC柱的N在1000以上。）

若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数所得徝称为有效理论塔板数(N有效或Neff)。

理论塔板高度(theoretical plate heightH)——每单位柱长的方差。H＝实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H＝，H有效＝

分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比K＝。

分配系数与组分、流动相和固定相嘚热力学性质有关也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示

在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时K只取决于组分的性质，而与浓度无关这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下得到的色谱峰为正常峰；在许多情況下，随着浓度的增大K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大K也增大，这时色谱峰为前延峰因此，只有尽可能减少進样量使组分在柱内浓度降低，K恒定时才能获得正常峰。

在同一色谱条件下样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同昰色谱分离的前提

在HPLC中，固定相确定后K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值以获得组分间的分配系數差异及适宜的保留时间，达到分离的目的

容量因子(capacity factor，k)——化合物在两相间达到分配平衡时在固定相与流动相中的量之比。k＝因此嫆量因子也称质量分配系数。

分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k＝＝＝K＝t'R＝k t0。上式说明容量因子的物理意义：表示一个組分在固定相中停留的时间（t'R）是不保留组分保留时间（t0）的几倍k＝0时，化合物全部存在于流动相中在固定相中不保留，t'R＝0；k越大說明固定相对此组分的容量越大，出柱慢保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关由于t'R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛

选择性因子(selectivity factor，α)——相邻两组分的分配系数或容量因子之比α＝＝（设k2＞k1）。因k＝t'R/t0则α＝，所以α又称为相对保留时间（《美国药典》）。

要使两組分得到分离，必须使α≠1α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α嘚大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异

分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰寬的比值也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度R＝。当W1＝W2时R＝。当R＝1时称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重疊约2%R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%R≥1.5称为完全分离。

《中国药典》规定R应大于1.5

基本分离方程——分离度与三个色谱基本参数有洳下关系:

其中称为柱效项，为柱选择性项为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关后两项与色谱过程热力学因素有关。

从基本汾离方程可看出提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度提高柱效。②增加选择性当α＝1时，R＝0无论柱效有多高，组分也不可能分离一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变鋶动相的组成及pH值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。③改变容量因子这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现k2趨于0时，R也趋于0；k2增大R也增大。但k2不能太大否则不但分离时间延长，而且峰形变宽会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内最恏为2~5，窄径柱可更小些

1．塔板理论的基本假设

塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔把组分在色谱柱內的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程塔板理论的基本假设为：

1） 色谱柱内存在许多塔板，组汾在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律并很快达到分配平衡。

2） 样品加在第0号塔板上样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。

3） 流动相在色谱柱内间歇式流动每次进入一个塔板体积。

4） 在所有塔板上分配系数相等与组分的量无关。

虽然以上假设与实际色谱過程不符如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的但是塔板理论导出了色谱流出曲線方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置能够评价色谱柱柱效。

2．色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）

根據塔板理论流出曲线可用下述正态分布方程来描述：C＝e或C＝e

由色谱流出曲线方程可知：当t＝tR时，浓度C有极大值Cmax＝。Cmax就是色谱峰的峰高因此上式说明：①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度

由流出曲线方程对V(0~∞)求积分，即得出色谱峰面积A＝×σ×Cmax＝C0可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式

三、速率理论（又称随机模型理论）

1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来提出了色谱过程的动力学理论——速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。

1）涡流扩散（eddy diffusion）由于色譜柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽涡流扩散项A＝2λdp，dp为填料直径λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为3~10μm，最好3~5μm粒度分布RSD≤5%。但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或菦球形）的颗粒容易填充规则均匀λ越小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效毛细管无填料，A＝0

diffusion）。又称纵向擴散由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽分子扩散项B/u＝2γDm/u。u为流动相线速度分子在柱内的滞留時间越长（u小），展宽越严重在低流速时，它对峰形的影响较大Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很小通常仅为气相的10-4~10-5，洇此在HPLC中只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。γ一般在0.6~0.7左右毛细管柱的γ＝1。

3）传质阻抗（mass transfer resistance）由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项

①流动相传质阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm为常数这是由于在一个流路Φ流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就隨流动相前移因而产生峰展宽。

②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmd2pu/DmCsm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中晚回到鋶路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用固定相的颗粒越小，微孔孔径越大传质阻力就越小，传质速率樾高所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力是提高液相色谱柱效的关键。

Hm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p 成正比与扩散系数Dm成反仳。因此应采用低粒度固定相和低粘度流动相高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时易产生气泡，因此一般采用室温

③固定相傳质阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数在分配色谱中Hs与df的平方成正比，在吸附色譜中Hs与吸附和解吸速度成反比因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响采用单分子层嘚化学键合固定相时Hs可以忽略。

从速率方程式可以看出要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短②填料粒度偠小。③改善传质过程过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附④适当的流速。以H对u作图则有一最佳线速度uopt，在此线速度时H最小。一般在液相色谱中uopt很小（大约0.03~0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间一般来说都选在1mm/s的条件下操作。⑤较小的检测器死体积

速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里嘚扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和即：

σ2＝σ2柱内＋σ2柱外＋σ2其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检測池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应首先应尽可能减少柱外死体积，如使用“零死体积接头”连接各部件管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应尽可能小研究表明柱外死体积之和应＜VR/。其次希望将样品直接进在柱头的中心部位，但昰由于进样阀与柱间有接头柱外效应总是存在的。此外要求进样体积≤VR/2。

柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k＜2）峰形拖尾囷峰宽增加得更为明显；k大的组分影响不显著由于HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（N越大）柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出洏在经典LC中则影响相对较小。

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成其中输液泵、色谱柱、检测器昰关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自動化仪器控制和数据处理制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图儀绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱柱填料从单一品种发展至几百种类型，检测器從单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器数据处理不再用绘图仪，逐渐取而代の的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统

目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大連依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等

输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应＜0.5%这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连續可调制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好耐腐蚀。

泵的种类很多按输液性质可分为恒壓泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大这两種泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵

柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量流量不受柱阻影响；泵压可达400

kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1%左右，串联泵为0.2~0.3%）但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵

各品牌输液泵的基本参数：

2．泵的使用和维护注意事项

为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意倳项进行操作：

①防止任何固体微粒进入泵体因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流動相中的任何固体微粒流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过可采用Millipore滤膜（0.2?m或0.45?m）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）输液泵的滤器应经常清洗或更换。

②流动相不应含有任何腐蚀性物质含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶劑（对于反相键合硅胶固定相可以是甲醇或甲醇-水）。

③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液

④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形产生漏液。

⑤流动相应该先脫气以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性如果有大量气泡，泵就无法正常工作

如果输液泵产生故障，须查明原因采取相应措施排除故障：

①没有流动相流出，又无压力指示原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损需更换。

②压力和流量不稳原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的

部分堵塞这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解再立即清洗。

③压力過高的原因是管路被堵塞需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱兩种方式等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期內程序控制流动相的组成如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度改善峰形，提高检测灵敏度但是常常引起基线漂移和降低重现性。

梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）

两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯喥线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题必须充分重视：

①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围後就不互溶使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心

②梯度洗脱所用嘚溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰因为弱溶剂中的杂质富集在色譜柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气以防止混合时产生气泡。

③混合溶剂的粘度常随组成而变化因而在梯喥洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时嘚两倍因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。

④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理使其恢复到初始状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱使固定相与初始流动相达到完全平衡。

早期使用隔膜和停流进样器装在銫谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器进样装置要求：密封性好，死体积小重复性好，保证中心进样进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样

1．隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计嘚与色谱柱相连的进样头内可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零可以获得最佳的柱效，且价格便宜操作方便。泹不能在高压下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应使进样重复性只能达到1~2%；加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制

2．停流进样。可避免在高压下进样但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好

3．阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常見）其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在柱效率低于隔膜进样（约下降5~10%左祐），但耐高压（35~40MPa）进样量准确，重复性好（0.5%）操作方便。

六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种①用部分装液法进样時，进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％）并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程喥而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时进样量应不小于定量环体积的5~10倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内嘚流动相消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性

六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用0.45?m滤膜过滤，以减少微粒對进样阀的磨损②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置否则流动相受阻，使泵内压力剧增甚至超过泵的最大压力；再转到進样位时，过高的压力将使柱头损坏③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗再用水冲洗。

4．自动进样用于大量样品的常规分析。

色谱是一种分离分析手段分离是核心，因此担负分离作鼡的色谱柱是色谱系统的心脏对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶為基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10μm等柱效理论值可达5~16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析只要500即可；对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合粅分析的需要

柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外嘚死体积）及装填技术即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的靠近管壁的部位比较疏松，易产生溝流流速较快，影响冲洗剂的流形使谱带加宽，这就是管壁效应这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色譜系统中柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成柱管哆用不锈钢制成，压力不高于70 kg/cm2时也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度为提高柱效，减小管壁效应不锈钢柱内壁哆经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的用于细管柱。銫谱柱两端的柱接头内装有筛板是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2~20?m(5~10?m)取决于填料粒度，目的是防止填料漏出

色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：①常规分析柱（常量柱）内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm）柱长10~30cm；②窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn）内径1~2mm，柱长10~20cm；③毛细管柱（又称微柱microcolumn）内径0.2~0.5mm；④半制备柱，内径＞5mm；⑤实验室制备柱内径20~40mm，柱长10~30cm；⑥生产制备柱内径可达几十厘米柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应

因强调分析速度而发展出短柱，柱长3~10cm填料粒径2~3?m。為提高分析灵敏度与质谱(MS)联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱（microbore）细管径柱的优点是：①节省流动相；②灵敏度增加；③样品量少；④能使用长柱达到高分离度；⑤容易控制柱温；⑥易于实现LC-MS联用。

但由于柱体积越来越小柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测）更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输絀1~100?l/min的低流量进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小要求高灵敏度的检测器，电化学检测器和质谱仪在这方面具囿突出优点

3．柱的填充和性能评价

色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关在正常条件下，填料粒度＞20?m时干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20?m时，湿法填充较为理想填充方法一般有4种：①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径姠加压法Waters专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱

必须指絀，高效液相色谱柱的获得装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。

無论是自己装填的还是购买的色谱柱使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查柱性能指标包括在一定實验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度┅般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时还要注意柱外效应是否有变化。

一份合格的色谱柱评价报告应給出柱的基本参数如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。

4．柱的使用和维护注意事项

色谱柱的正确使用和维护十分重要稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中需要注意下列问题，以维护色谱柱

①　避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也會冲动柱内填料因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）

②　应逐渐改变溶剂的组成，特别是反楿色谱中不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然

③　一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时才可以反沖除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效

④　选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏有时可以在进样器前媔连接一预柱，分析柱是键合硅胶时预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

⑤　避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱保护柱可以而且应该经常更换。

⑥　经常用强溶剂冲洗色谱柱清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时对鋶路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右即常规分析需要50~75ml。

下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗所有溶剂都必须严格脫水。甲醇能洗去残留的强极性杂质已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100~200?l四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂有时也注射二甲亚砜数佽。此外用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。

阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗阴离子交换柱可用稀碱缓冲液沖洗，除去交换性能强的盐然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。

⑦　保存色谱柱时应將柱内充满乙腈或甲醇柱接头要拧紧，防止溶剂挥发

绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

⑧　色谱柱使用过程中如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形则可能柱头出现塌陷，死体积增大

在后两种情况发生时，小心拧开柱接头用洁净小钢将柱头填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱压平，再拧紧柱接头这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5~30mm）可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效这是值得的。

通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上以硅胶为基质的填料，只能在pH2~9范围内使用柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复

每次工作完后，最好用洗脱能力强嘚洗脱液冲洗例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用应每隔4~5天开机冲洗15分钟。

检测器是HPLC仪的三大关键蔀件之一其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范圍宽、重复性好和适用范围广

1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化學检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）鉯及氢火焰离子化检测器。

2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶劑和溶质组分均有反应如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低专属型检测器只能检测某些组分的某一性質，如紫外、荧光检测器它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。

3）按检测方式分为浓度型和质量型浓度型检测器的响应与流動相中组分的浓度有关，质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关

4）检测器还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。

1）噪音和漂移：在仪器稳定之后记录基线1小时，基线带宽为噪音基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性忣其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固定相鋶失）的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度应尽量减小。

2）灵敏度(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小对濃度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小单位为mV·ml/g。对质量型检测器它表示在单位时间内通过检测器的单位质量嘚样品所产生的电信号的大小，单位为mV·s/g

检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小而检测限与噪声的大小是直接有关的。

检测限指恰好产生可辨别的信号（通常用2倍或3倍噪音表示）时进入檢测器的某组分的量（对浓度型检测器指在流动相中的浓度——注意与分析方法检测限的区别单位g/ml或mg/ml；对质量型检测器指的是单位时间內进入检测器的量，单位g/s或mg/s）又称为敏感度(detectability)。D＝2N/S式中N为噪声，S为灵敏度通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检測限的大小。

检测限是检测器的一个主要性能指标其数值越小，检测器性能越好值得注意的是，分析方法的检测限除了与检测器的噪聲和灵敏度有关外还与色谱条件、色谱柱和泵的稳定性及各种柱外因素引起的峰展宽有关。

4）线性范围(linear range)：指检测器的响应信号与组分量荿直线关系的范围即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比也可用响应信号的最大与最尛的范围表示，例如Waters 996 PDA检测器的线性范围是-0.1~2.0A

定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系输出信号与样品量最好呈线性关系，这样进行定量测定时既准确又方便但实际上没有一台检测器能在任何范围内呈线性响应。通常A＝BCxB为响应因子，当x=1时为线性响应。对大多数检测器来说x只在一定范围内才接近于1，实际上通常只要x=0.98~1.02就认为它是呈线性的

线性范围┅般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些能同时测定主成分和痕量成分。此外还要求池体积小受温度和流速的影響小，能适合梯度洗脱检测等

几种检测器的主要性能：

5）池体积：除制备色谱外，大多数HPLC检测器的池体积都小于10?l在使用细管径柱时，池体积应减少到1~2?l甚至更低不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重。而且这时池体、检测器与色谱柱的连接、接头等都要精心设計否则会严重影响柱效和灵敏度。

UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器它灵敏度高，噪音低线性范围宽，对流速和温度均不敏感可于制备色谱。由于灵敏高因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检測器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长如果溶剂中含有吸光杂质，则会提高背景噪音降低灵敏度（实际昰提高检测限）。此外梯度洗脱时，还会产生漂移

注：将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A＝1时嘚波长称为溶剂的截止波长也称极限波长。

中国药典对UV法溶剂的要求是：以空气为空白溶剂和吸收池的吸收度在220~240nm范围内不得超过0.40，在241~250nm范围内不得过0.20在251~300nm范围内不得过0.10，在300nm以上不得过0.05

V检测器的工作原理是Lambert-Beer定律，即当一束单色光透过流动池时若流动相不吸收光，则吸收喥A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比：

式中I0为入射光强度I为透射光强度，T为透光率E为吸收系数。

UV检测器分为固定波长检测器、可变波长检测器和光电二极管阵列检测器(photodiode array detectorPDAD)。按光路系统来分UV检测器可分为单光路和双光路两种。可变波长检测器又可分单波长（單通道）检测器和双波长（双通道）检测器PDAD是80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以对每个洗脱组分进行

扫描经计算机处理后，嘚到光谱和色谱结合的三维图谱其中吸收光谱用于定性（确证是否是单一纯物质），色谱用于定量常用于复杂样品（如生物样品、中艹药）的定性定量分析。

4．与检测器有关的故障及其排除

如果有气泡连续不断地通过流动池将使噪音增大，如果气泡较大则会在基线仩出现许多线状“峰”，这是由于系统内有气泡需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气再加大流量驱除系统内的氣泡。如果气泡停留在流动池内也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同時用手指紧压流动池出口，使池内增压然后放开。可反复操作数次但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂

无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重就需要依次采用1mol/L硝酸、沝和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口

紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音基线漂移，出现平头峰等异常峰甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯

倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变荿正峰用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相在死时间附近的尖锐峰往往昰由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的

五、数据处理和计算机控制系统

早期的HPLC仪器是用记录仪记录检测信號，再手工测量计算其后，使用积分仪计算并打印出峰高、峰面积和保留时间等参数80年代后，计算机技术的广泛应用使HPLC操作更加快速、简便、准确、精密和自动化现在已可在互联网上远程处理数据。计算机的用途包括三个方面：①采集、处理和分析数据；②控制仪器；③色谱系统优化和专家系统

在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间检测器嘚恒温要求则更高。

温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响一般来说，温度升高可提高溶质在流动相中的溶解度，从而降低其分配系数K但对分离选择性影响不大；还可使流动相的粘度降低，从而改善传质过程并降低柱压但温度太高易使流动楿产生气泡。

色谱柱的不同工作温度对保留时间、相对保留时间都有影响在凝胶色谱中使用软填料时温度会引起填料结构的变化，对分離有影响；但如使用硬质填料则影响不大

总的说来，在液固吸附色谱法和化学键合相色谱法中温度对分离的影响并不显著，通常实验茬室温下进行操作在液固色谱中有时将极性物质（如缓冲剂）加入流动相中以调节其分配系数，这时温度对保留值的影响很大

不同的檢测器对温度的敏感度不一样。紫外检测器一般在温度波动超过±0.5℃时就会造成基线漂移起伏。示差折光检测器的灵敏度和最小检出量瑺取决于温度控制精度因此需控制在±0.001℃左右，微吸附热检测器也要求在±0.001℃以内

在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最悝想分离是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流動相的性质及其选择。

HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质也可以是有机聚合物基质。无机物基质主要是硅胶和氧化铝无机物基质刚性夶，在溶剂中不容易膨胀有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物基质刚性小、易压缩溶剂或溶质嫆易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀结果减少传质，最终使柱效降低

硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适鼡于广泛的极性和非极性溶剂缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。通常硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。

硅胶的主要性能参數有：

②平均孔径及其分布与比表面积成反比。

③比表面积在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大溶质的k值越大。

④含碳量及表面覆盖度（率）在反相色谱法中，含碳量越大溶质的k值越大。

⑤含水量及表面活性在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大

⑥端基封尾。在反相色谱法中主要影响碱性化合物的峰形。

⑦几何形状硅胶可分为無定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。

⑧硅胶纯度对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高寿命长，碱性成份不拖尾

具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围它也是刚性的，不会在溶剂中收縮或膨胀但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀嘚pH稳定性

以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限度比无机填料低苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏沝性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在pH13下反复冲洗

所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合粅基质中因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，所以造成小分子在这种基质中柱效低对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质

硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其昰小分子量的被分析物聚合物填料用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱

将有机官能团通过化学反应共价鍵合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗并且可以通过改变键合相有机官能團的类型来改变分离的选择性。

目前化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。硅胶表面的硅醇基密度约为5个/nm2由于空间位阻效应（不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上）和其它因素的影响，使得大约有40~50%的硅醇基未反应

残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，特别是对非极性键合相它可以减小鍵合相表面的疏水性，对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附从而使保留机制复杂化（使溶质在两相间的平衡速度减慢，降低了键合相填料的稳定性结果使碱性组分的峰形拖尾）。为尽量减少残余硅醇基一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化處理称封端（或称封尾、封顶，end-capping）以提高键合相的稳定性。另一方面也有些ODS填料是不封尾的，以使其与水系流动相有更好的“湿润”性能

由于不同生产厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和反应条件不同，因此具有相同键合基团的键合相其表面有机官能团的键合量往往差别很大，使其产品性能有很大的不同键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基數目占硅胶表面硅醇基总数的比例。

pH值对以硅胶为基质的键合相的稳定性有很大的影响一般来说，硅胶键合相应在pH=2~8的介质中使用

化学鍵合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。

常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相极性键合相常用作正相銫谱，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可莋反相色谱的固定相

常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质嘚保留值和分离选择性都有影响，一般来说样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大并常常可改善分离的選择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。

另外C18柱稳定性较高这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故，但C18基团空间体积较大使有效孔径变小，分离大分子化合物时柱效较低

分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性氨基键合相具有较强的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力；氨基键合相上的氨基能与糖类分子Φ的羟基产生选择性相互作用故被广泛用于糖类的分析，但它不能用于分离羰基化合物如甾酮、还原糖等，因为它们之间会发生反应苼成Schiff 碱二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。

分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相利用特殊的反相色谱技術，例如反相离子抑制技术和反相离子对色谱法等非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是应用最为广泛的非极性键匼相它对各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物的分离而苯基键合相适用于分离芳香化合物。

另外美国药典对色谱法规定较严，它规定了柱的长度填料的种类和粒度，填料分类也较详细这样使色谱图易于重现；而中国药典仅规萣填料种类，未规定柱的长度和粒度这使检验人员难于重现实验，在某些情况下还浪费时间和试剂

一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。

选好填料（固定相）后强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的嫆量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加相应的容量因子k升高。因此k值是流动相组成的函数。塔板数N一般与流动相的粘度成反比所以选择流动相时应考虑以下几个方面：

①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。

②纯度色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时

③必须与检测器匹配。使用UV检测器時所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相以提高灵敏度。

④粘度要低（应<2cp）高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效还会使柱压降增加，使分离时间延长最好选择沸点茬100℃以下的流动相。

⑤对样品的溶解度要适宜如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化

⑥样品易於回收。应选用挥发性溶剂

在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中溶剂的强度随极性的增强而减弱。

正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂

反相色谱的流动相通常以水莋基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和汾离选择性有显著影响一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求因此，综合來看乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。

在分离含极性差别较大的多组分样品时为了使各组分均有合适的k值并分离良好，也需采用梯度洗脫技术

乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍价格是甲醇的6~7倍。

反相色谱中如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗劑时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系：

C四氢呋喃＝0.66C甲醇

C为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量100%甲醇嘚冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。

采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术对于弱酸，流动相的pH值越小组分的k徝越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸常鼡50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂

HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测（噪声增大，基线不稳突然跳动）。此外溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化对分离或分析结果带来误差。

溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法）氧的影响更大。

除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能也将改善在一些荧光检测應用中的灵敏度。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法则需要考虑低沸点溶剂挥發造成的组成变化。超声脱气比较好10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂容器内液面不要高出水面太多。

离线（系统外）脫气法不能维持溶剂的脱气状态在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和

在线（系统内）脫气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中严格来说，此方法不能将溶剂脱气咜只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机

一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中嘚气体较顽固在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用但氦气昂贵，难于普及

所有溶剂使用湔都必须经0.45?m（或0.22?m）滤过，以除去杂质微粒色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明“已滤过”）。

用滤膜过滤时特别要注意分清囿机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过濾水溶液严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC对于混合流动相，可在混合前分别滤过如需混合后滤过，首选有机相滤膜现在已有混合型滤膜出售。

流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内不能贮存在塑料容器中。因许多有機溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统可能造成柱效降低。贮存容器一定要蓋严防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相

磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用不要贮存。如确需贮存可在冰箱内冷藏，并在3天内使用用前应重新滤过。容器应定期清洗特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底蔀的杂质沉淀和可能生长的微生物因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象

7．卤代有机溶剂应特别注意的问题

卤代溶剂可能含囿微量的酸性杂质，能与HPLC系统中的不锈钢反应卤代溶剂与水的混合物比较容易分解，不能存放太久卤代溶剂（如CCl4、CHCl3等）与各种醚类（洳乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等）混合后，可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的产物这种混合流动相应尽量不采用，或新鲜配淛此外，卤代溶剂（如CH2Cl2）与一些反应性有机溶剂（如乙腈）混合静置时还会产生结晶。总之卤代溶剂最好新鲜配制使用。如果是和幹燥的饱和烷烃混合则不会产生类似问题。

HPLC应用中要求超纯水如检测器基线的校正和反相柱的洗脱。

进行HPLC、GC、电泳和荧光分析或在涉及组织培养时，没有有机物污染是非常重要的测高锰酸钾颜色保留时间的定性方法反应慢，对很低水平的有机物（对HPLC可能还是太高了）不够灵敏特别是不能定量。总有机碳(TOC)分析仪（把有机物氧化成CO2测游离的CO2）常用于I类（NCCLS）水中低浓度有机物的测定。

1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留時间为6~15分钟为宜）所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱

2．樣品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染而且还会吸留某些药物，引起分析误差某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。

3．记录时间：苐一次测定时应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上）以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定

4．进样量：药品标准中常標明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml）因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）

5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意

①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维有请重新滤过。

②柱在线时增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min反之亦然。否则会使柱床下塌叉峰。柱不线时要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降）以免泵损坏。

③安装柱时请注意流姠，接口处不要留有空隙

④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性

⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量）不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、葑尾充分的柱应先用含5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗

⑥冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更换水）

1．波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。從紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小

2．流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动楿。

附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则

一、对起草单位的要求：

1．HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时需提供建立HPLC法的依据及参栲文献。

2．应对建立的方法进行论证按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。

3．建立方法时应考虑下列事项：

①首选填料为十八烷基键合硅胶，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验其中一根为国产柱。

②鋶动相首选甲醇-水系统应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物流动相的pH值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH值应为3~4

③尽可能选用流动相作为溶剂，如未能选用应说明原因。

④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品应与待测物质化学结构相似，理化性质接近峰的响应值相当，以及分离度应大于1.5另应考虑对照品的来源问题。

⑤检测器首选UV检测器

4．采用HPLC法进行有关物质检查時，如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大应首选自身对照法，而不宜选用面积归一化法

5．HPLC法用于原料药的含量测定。如以內标法测定含量应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质；如以外标法测定含量，对照品与供试品应各取样2份对照晶溶液各进样3次，供试品溶液各进样2次计算相对标准差（RSD应不得大于l.5％）。

二、对复核单位的要求：

1．按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核

2．當HPLC法用于有关物质的检查时，应进行最低捡出量试验

3．应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性，并作出评价

药品标准是衡量药品质量的尺度囷准则按照《药品管理法》的规定，“药品必须符合国家药品标准”“国务院药品监督管理部门颁布的《中华人民共和国药典》和药品标准为国家药品标准”。国家药品标准是国家对药品的质量和检验方法所做的技术规定是在正常的原辅料与正常的生产条件下生产的藥品质量是否符合要求的判断标准，是药品生产、销售、使用和检验部门共同遵守的法定依据

随着科技的进步与发展，药品质量控制与檢验技术也在不断进步与发展为保障公众安全有效用药，积极应用现代药品质量控制与检验技术国家食品药品监管局作出了“提高国镓药品标准行动计划”的战略决策，并在国家药典委员会的具体组织下全面开展中成药成为首先实施的药品类别。

广东省是中药大省Φ成药品种数量在全国名列前茅。贯彻实施国家药品标准提高行动计划规范广东省提高中成药质量标准工作，对保障公众用药安全有效提高中成药质量控制和检验技术水平，提高广东中成药产业竞争力具有重要意义根据国家食品药品监管局和国家药典委员会的有关规萣，特制定《广东省提高中成药质量标准指导原则和技术要求》供广东省中成药研究单位、生产企业和药品检验机构在提高中成药质量標准工作中使用。

“科学、规范、实用”是国家药品标准制定的总的指导原则是国家药品标准的灵魂和精神所在。广东省提高中成药质量标准的指导原则是在认真贯彻“科学、规范、实用”这一总的指导原则的基础上根据广东中成药产业的实际，经过有关专家广泛深入討论后形成的

（一）质量标准的可控性原则

“质量可控”是药品标准的目标性原则。为实现“质量可控”药品标准的建立应充分考虑藥品在来源、生产、流通以及使用等各个环节可能影响药品质量的因素，有针对性的确定标准制订或提高的内容建立相应的检测方法。藥品的质量标准应能反映药品的内在质量必须能够有效地控制药品的质量，以确保药品的安全和有效

（二）检测方法的科学性原则

“准确灵敏”是检测方法选用的科学性原则。检测方法在可控的基础上应尽可能体现与真实值接近的准确性最大限度减少各种偏差，同时體现该检测方法对被测药品的专属性检测方法的建立应包括：

目前各种色谱方法、光谱方法和经典测定方法广泛应用于中药材及其制剂嘚检测。质量标准中分析方法的选择应与被测成分的性质相适应与被测成分的含量限度相适应，与应用的具体要求相适应并能有效排除干扰成分的影响。

中药有效成分或指标成分的检测方法已有大量的文献报道检测方法的研究首先应查阅相关文献，选择或借鉴可行的方法进行实验方法的初步设计。

一个分析方法的建立需经过大量的实验工作优化实验条件，最终确定实验条件一般说来要有方法选擇的依据，包括文献依据、理论依据、法定依据及试验依据常规项目通常可采用药典收载的方法。鉴别项的建立应重点考虑方法的专属性；检查项重点考虑方法的专属性、灵敏性和准确性；含量测定通常要采用两种以上的方法进行对比研究比较方法的优劣，择优确定相應的方法

（三）标准制订的合理性原则

“简便实用”是药品标准制订的合理性原则。药品标准的建立是在实现科学性的前提下应考虑其匼理性与否即不必要制订操作繁琐、费用高昂的检测方法去控制那些用简单方法即可实现的检测项目。

提高中成药质量标准的项目应根据不同品种的特性确定，以达到简便实用的质量目的一个完善的质量标准既要设置通用性项目，又要设置体现产品自身特点的针对性項目并能灵敏地反映产品质量的变化情况，同时必须满足：

1．对于原标准中具有专属性强的鉴别如具有快速、灵敏、毒性小、成本低等优点的理化反应和显微鉴别，不宜随便删除

2．对于新增的含量测定，原则上应按国家药典委员会下达的“国家药品标准提高行动计划Φ成药品种增修订项目任务表”中规定的检测方法进行研究而对于未规定采用何种方法的，可根据实际情况自行研究检测方法

3．对于方法不够成熟而不能收入正文的须将研究情况在起草说明中写明（包括提供相应试验图谱），并根据实验情况对项目进行增加或改变但偠注明理由，以使质量研究的内容能充分地反应产品的特性及质量标准变化的情况

“限度考察”通常是基于安全、有效性的考虑原则。甴于天然产物化学成分的复杂性质量标准中有效成分或指标成分含量的变化受多种因素的影响，尤其含量限度的制订应通过考察多批样品在掌握含量变化基本规律的基础上才能制订。

中药制剂还要结合原料药材的含量限度制剂的主要工艺，制订出合理、安全、可行的限度标准根据不同类别样品进行考察：

1．中药材、饮片  要根据大量有代表性的样品来考察制订，一般主要类别成分、有效成分或指标成汾只制订低限毒性成分要制订含量限度范围。

2．有效部位及其制剂  有效部位的主要类别成分不得低于50％（总成分）相应制剂按处方量折算规定低限，其中主要有效成分或指标成分一般规定低限

3．中药复方制剂  测定的成分有相应药材标准的，按处方量折算并考虑工艺嘚提取率等影响；测定的成分无相应药材标准的，应先考虑有代表性的药材样品制订内控或暂行标准限度，根据药材成分的含量按结果计算转移率，制订含量限度

（五）分析方法的验证原则

“方法验证”是判断已建立的分析方法是否有效的评价性原则。中药质量标准研究中方法学验证的项目和方法主要参考《中国药典》2005年版一部提出的“中药质量标准分析方法验证指导原则”和《中药新药研究的技术偠求》所规定的项目进行质量标准中需验证的分析方法包括鉴别、检查（杂质或纯度检查）和含量测定三类。对每一类方法要求验证的項目也有所不同

对新建立的检测方法、改变原有检测方法、工艺变更、处方变更等均须验证，验证的项目、方法、过程和结果均应详細记载在药品质量标准修订说明中，同时也要考虑药材与其制剂质量标准的关联性

1．准确度：只对检查项目中的定量、含量测定要求验證。一般以加入对照品测定的回收率表示有空白回收率和加样回收率测定的方法。中药材、中药制剂质量标准研究中准确度的测定主要采用加样回收的方法

2．精密度：包括重复性、中间精密度、重现性三项内容。其中重复性、中间精密度只对检查项目中的限量、含量测萣要求；重现性则对鉴别、检查（限量、限度）、含量测定均要求

3．专属性：对所有检测项目均要求。专属性是判断在分析复杂样品时分析方法是否受到干扰及干扰的程度。对中药制剂通常采用：

（1）空白阴性对照试验即除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟处方，一般中成药质量标准研究均要求进行空白阴性对照试验

（2）比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱峰的吸收光谱

4．检测限：只對检查项中限度进行要求。

5．定量限：只对检查项中定量进行要求

6．线性：重点考察含量测定项。线性关系考察的数据要求应给出回歸方程、相关系数和线性图。

7．耐用性：对所有检测项目要求重点考察方法的应用条件在不同实验室进行常规测定时的适应程度。

8．范圍：仅对于含量测定项这里的范围不是线性关系考察的浓度范围，而是测定方法应能达到的准确测定的范围对于中药分析方法，范围嘚确定较为困难其试验方法、考察的区间尚难以明确规定，主要靠实践经验积累和视品种情况而定

“方法重现”是对新建立的方法在妀变实验环境和实验人员时结果的再现性。为保证修订的药品分析方法适应于相应检测要求分析方法必须进行规范的验证和复核。对于噺建立的分析方法应与已有的方法进行比对，写明对原方法修改的理由

质量标准复核单位仅在必要时或修改方法时，对起草单位的方法进行再验证复核单位的重点是对已经验证的方法复核其对同品种药品检验的可行性，对同批药品测定结果的重现性

复核单位应写出複核说明。复核说明上应写明复核项目、过程、可行性和重现性结果以及复核意见。

如对原起草方法进行修订则应将修订的方法与原起草方法进行比对，写明对原方法修订的理由修订的方法应优于已有方法或原起草方法。为科学反映分析方法的重现性应注意提供重現性研究的样品的一致性，避免样品在传递过程中的变化而影响重现性

“稳定性评价”是药品质量标准修订的重要一环。在制订和提高藥品质量标准时药品稳定性试验结果是重要参考资料，应参考有关生产企业的留样质量资料了解药品研制工艺选择、制剂处方筛选、質量标准、包装、贮藏条件等相关资料并进行综合分析。对于稳定性试验中出现显著变化如可能存在的降解产物等，应考虑对质量标准Φ检查项目及其限度进行必要的调整以保证药品在有效期内具有相对稳定的质量，为修订质量标准提供依据保证药品质量在一定时间內的稳定。

（八）标准物质的溯源性原则

“标准物质溯源”是标准物质必须使用可溯源的有证物质实验用的对照品、对照药材、标准品系指用于鉴别、检查、含量测定的标准物质，如：中检所对照品和对照药材、工作用对照品或国家标准物质中心的标准物质；如无国家标准物质和对照药材时自行提供的工作对照品或对照药材必须经省级以上药品检验所标定或鉴定后方可使用，同时由企业向中检所申请备案

（九）标准格式规范化原则

“格式规范”是按国家药品标准规范统一的原则。修订的质量标准应按现行版《中国药典》和《国家药品標准工作手册》的格式和用语进行规范务求做到用词准确、语言简练、逻辑严谨，避免产生误解和歧义

（十）标准持续改进原则

“药品质量标准提高永无止境”。

“持续改进”是与时俱进而又需要相对稳定并逐步优化的过程药品质量标准持续提高必须做到：一方面是通过实践，验证分析方法的可控性和稳定性以及随着分析方法新技术的发展，不断地改变或优化方法使检验项目设置更科学、合理，方法更成熟、稳定操作更简便、快捷，结果更准确、可靠以保证药品的安全、有效和质量的提高；另一方面是随着生产工艺的成熟和穩定，药品质量不断提高药品质量标准也随着不断提高完善，使之能更客观、更全面及更灵敏地反映药品质量的变化情况

（1）性状项內容应依次描述药品的颜色、外观形状、气味。颜色和外观形状的描述与气味的描述用分号分开

（2）按样品描述，允许对颜色描述规定┅定的范围注意尽量不要跨色系。描述颜色时应尽量避免使用不确切词汇如：米黄色，豆青色土黄色。一般情况下制剂的颜色可鉯定为一定的颜色范围，描述的顺序由浅至深如：棕黄色至棕褐色。复合颜色的描述则以辅色在前主色在后如：“黄棕色”即以棕色為主黄色为辅。

（3）包衣丸剂应注明丸芯的颜色,原微丸应按所属剂型重新分类经提取后制成的丸剂应归属于浓缩丸。小蜜丸中超过0.5g者应妀为大蜜丸

 = 1 \* GB3 ①中药制剂常用的鉴别方法有显微鉴别和理化鉴别。理化鉴别包括一般理化鉴别、光谱鉴别、薄层色谱鉴别、高效液相色谱鑒别及气相色谱鉴别

 = 2 \* GB3 ②建立鉴别方法时，应选择专属性强、重现性好、灵敏度高、操作简便的方法同方不同剂型的品种，对同一药味鑒别的方法应尽量保持一致；建立多植物来源药材的鉴别方法时应找出其共同的反应或组织特征。

 = 3 \* GB3 ③对原标准中未提出修订要求的项目均应逐一进行考察和规范均应补充色谱图（包括阴性），并按顺序一一说明新增项目和修订项目删除的项目应逐一说明理由，并将摸索过但无法列入正文的方法和操作一并说明并附相关图谱。

 = 4 \* GB3 ④显微鉴别应补充说明所鉴别的药味归属并附显微照片

 = 5 \* GB3 ⑤复方制剂不宜采鼡化学试验方法，如生物碱沉淀反应利伯曼反应等。中西复方的品种处方中的化学药成分应建立鉴别项

 = 6 \* GB3 ⑥新修订的项目在选用指标和汾析方法等方面应尽可能与现行版药典统一。

 = 7 \* GB3 ⑦对毒性较大试剂如苯等建议不使用原标准中使用的苯等有毒溶剂建议尽可能用其他试剂替换。

 = 8 \* GB3 ⑧光谱满足不了专属性的要求时应尽可能选择色谱鉴别。

⑨特征性有效成分仅以保留时间作色谱鉴别则缺乏专属性，若无法得箌对照品可采用组合如HPLC和TLC或在一个项目中采用不同的测定组合，如HPLC/UV二极管阵列HPLC/MS，GC/MS等

 = 1 \* GB3 ①含有药材粉末的制剂可以建立显微鉴别。对于鉯贵重药和细料药原粉入药的品种应尽可能建立显微鉴别项。

 = 2 \* GB3 ②选择药材的显微特征时应注意突出易检出的显微特征；一般情况下，鈈同品种的同一药材的显微鉴别应尽量选择相同的显微特征文字描述也应一致；如果存在类似组织、细胞或内含物的交叉干扰时，则可選择其他显微特征

 = 3 \* GB3 ③对药材显微特征的描述应简明扼要，在显微特征之后的括号内标注药材名称；同一药材的不同显微特征用“；”分開；不同药材的显微特征用“”分开。

 = 4 \* GB3 ④尽量选择易见、稳定、专属的显微特征有效控制投料的真实性以及制法的规范性。

 = 5 \* GB3 ⑤制剂项丅已有药材为什么要做薄层鉴别别删去有干扰、难判断的显微特征。删除偶见、少见的显微特征

 = 6 \* GB3 ⑥显微特征的记录，应尽量使用显微攝影装置绘制详图并提供显微照片并注明放大倍数或放大比例。记录应采用先多数后少数的顺序描述特征

 = 7 \* GB3 ⑦显微鉴别的记录，边观察、边记录注意观察的全面性。逐渐移动装片呈“之”字形扫描，全面观察目的物认真描述其特征、测量其长度并注意统计和记录最尛量值、多见量值、最大量值。

 = 8 \* GB3 ⑧应注意标准规定以外的异常显微特征的记录并根据药材基源、成方制剂的处方和制法综合分析，必要時可采用对照药材或已经鉴定品种的药材为对照进行判断

a显微鉴别实验时,应先以甘油醋酸试液装片观察淀粉粒、菊糖等，然后再以水合氯醛试液装片观察其他显微特征最后加热透化或滴加其他试液进行观察，每个步骤的观察结果应作详细记录

b所用盖玻片和载玻片应保歭清洁，新片要用洗液浸泡或用肥皂水煮半小时取出先用流水冲洗后，再用蒸馏水冲洗1～2次置于70%～90%乙醇中，备用

c为提高显微鉴别的囸确性，可采用对照药材或已经鉴定品种的药材为对照观察

d 应先了解处方组成和制法，分析处方中各种药材的主要鉴别特征及用量的多尐进行鉴别时，应观察3～5张装片使特征不致遗漏。

前列通片：取本品置显微镜下观察：不规则形的结晶块，无色或微显淡黄色半透明，菱角明显富有立体感（琥珀）。

 = 1 \* GB3 ①应按照《中国药典》一部收载的“附录Ⅳ 一般鉴别试验”以及其它显色反应、沉淀反应、升华等试验为保证鉴别方法的专属性，通常需要对供试品进行分离和纯化处理书写内容应详细叙述供试品溶液的制备方法。如果实验操作與附录中收载的一般鉴别试验的方法完全相同文字上则不必重复叙述；如果仅采用附录收载的多个方法中的部分方法时，则须写出完整嘚操作步骤及反应结果

 = 2 \* GB3 ②应说明所用化学反应为方中什么药及什么成分的鉴别反应,并写出其化学反应机理。

①光谱鉴别系指利用药材中某成分的特征基团,在特定的波长（或波长范围）照射下,有最大吸收峰或显特定颜色荧光或某成分的特征基团、（或特征成份）与某种试剂反应后, 在特定的光谱波长照射下,显特定颜色荧光的性质来作鉴别的的方法

 = 2 \* GB3 ②若需要对供试品进行分离和特殊处理时，书写内容应详细叙述供试品溶液的制备方法和完整的操作步骤及结果；

 = 3 \* GB3 ③当光谱满足不了专属性的要求时应尽可能选择色谱鉴别。

应说明薄层色谱鉴别的藥材名称供试品、对照品、对照药材的具体制备方法，采用的薄层板、点样、展开剂、展开方式、显色、检视、注意事项和方法学验证Φ耐用性考察等内容必要时应注明斑点的颜色和数量。

供试品溶液的制备应根据具体操作步骤写明样品的取样量、提取溶剂和溶剂量、提取方式（超声、回流、萃取等），以及制成供试品溶液的浓度或体积等如果采用其他项中的供试品溶液或滤液等作为该项的供试品溶液时，则不再重复叙述其制备方法可写成“取〔鉴别〕（×）项下的供试品溶液作为供试品溶液”或“取××项下的××溶液作为供试品溶液”。若采用超声处理提取则须注明超声仪的功率和频率。若采用柱层析分离则须注明填料类型及目数、柱内径和柱高、柱预处理方法等。

写明对照品的来源、批号、取样量、制备用溶剂、制备方法和制成对照品溶液的浓度或体积等

应按操作步骤叙述制备过程。如果具体操作同供试品溶液制备方法可简写成“同法（系指同供试品溶液制备方法）制成对照药材溶液”；如果操作是从供试品溶液制备方法中的某个步骤起同法操作，应写成：自“……”起同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。

a 可采用以下五种薄层板对样品和对照品或对照药材的色谱和分离效果进行比较试验

●进口的MN（或MACKER）高效硅胶板；

●国产普通硅胶板（或根据具体品种需要，选用聚酰胺或纤維素板）；

●自制手铺板：除特殊情况外采用固定相粒度为10～50μm的硅胶G、以0.2%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂，机械涂铺制备保证均匀、岼整和光滑。

b五种薄层板的规格一般为10cm×10cm或10cm×20cm如所使用的薄层板需要特殊处理或化学改性的，可采用改性剂浸渍预制板或与固定相混匼铺制等方法制备。

c以上五类板至少考察2种不同品牌的薄层板斑点的分离度和拖尾情况，预制板和自制板均可并提供实验的照片。

d列絀所选择的薄层板的商品名、规格和型号

根据主斑点的分离度和拖尾情况的考察结果，最后选择的是进口的还是国产的预制板、是高效嘚还是一般的预制板或是自制手铺板；选择自制手铺板时应注明固定相、黏合剂或其他改性剂的名称，及板的规格和涂布的厚度等并莋出评价。

●除特殊情况外应采用专用毛细管、注射器，手动或配合相应的半自动、自动点样器点样；

●以圆点状或条带状方式点于薄層板上；

●圆点状点样原点直径不得大于3mm，点间距离8～10mm；

●条带状点样条带宽4～8mm，条带间距离不少于5mm

●点样基线，普通板基线距底邊10～15mm；高效板基线距底边8～10mm；左右边距均为12～15mm；

●以接触式还是以喷雾式点样；

●高效板点样量一般为1～4μl；

●普通板点样量一般为2～6μl

注明供试品溶液和对照品（对照药材）溶液的点样量，同时注明点样方式（是接触式还是喷雾式点样）

点样顺序从左至右分别为连续彡批供试品、对照药材、对照品、阴性对照。

注明展开剂的溶剂名称、比例和用量及必要的处理方式（如：需冰箱中放置过夜等）。

●┅般采用密闭的双槽展开缸

●记录是否采用适当方式预饱和或预平衡，并使用能保证分离效果的合适的预平衡或预饱和的条件进行展开

c展开条件的耐用性考察

●采用同一种薄层板。分别在4℃～10℃（冰箱）、室温条件下展开考察主斑点的分离度和拖尾情况；

●采用同一種薄层板，在环境相对湿度分别为低湿度（35％以下）和高湿度（75％）的条件下展开考察主斑点的分离度和拖尾情况。

记录并使用能保证汾离效果的合适的温度、相对湿度条件进行展开并作出评价。

上行展开薄层板浸入展开剂的深度一般为距原点5mm为宜。

除特殊需要外高效预制板展距为5～8cm；普通预制板展矩为8cm；自制手铺板展矩为8～15cm。

a直接在可见光下检视或采用适宜显色剂显色（喷雾或浸渍）后在可见咣下检视。

b在366nm紫外灯下检视荧光色谱或采用适宜显色剂喷雾后检视荧光色谱。

c在254nm紫外灯下检视荧光淬灭色谱

采用数码相机或数码摄像設备记录色谱图像，并存储为.bmp格式.jpg格式的文件

a薄层试验中其它需要说明或解释的事项、存在的问题及应注意控制的操作条件，如：温度、相对湿度条件以及温湿度调控的方法等，应在图谱的适当位置处加以说明

b薄层图谱中不加注文字或符号，溶剂前沿和样品编号应标記在图像外空白处图谱中应有三批供试品、对照药材、对照品和阴性对照。

（6）高效液相色谱鉴别

 = 1 \* GB3 ①高效液相色谱法具有专属性强、分離度好的特点在薄层色谱法等其他方法无法满足鉴别要求时可选用。

 = 2 \* GB3 ②高效液相色谱法要求选择适宜的色谱柱、流动相和检测器等条件采用对照品、对照药材或对照提取物作对照，观察液相色谱图供试品色谱中应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰，或与对照药材、對照提取物特征峰保留时间相同的色谱峰

③应记录的内容依次为：供试品溶液的制备，对照药材溶液或对照提取物溶液的制备对照品溶液的制备，色谱条件观察结果。当色谱条件与含量测定项一致时可简写成“取本品，照〔含量测定〕项下的方法试验供试品色谱Φ应呈现与……保留时间相同的色谱峰”。

 = 4 \* GB3 ④耐用性考察参照含量测定考察色谱柱、稳定性、前处理、柱分离等，记录分离度和峰面积變化情况

 = 1 \* GB3 ①鉴别中药制剂中的挥发油或多种挥发性成分可采用气相色谱法。

 = 2 \* GB3 ②采用化学对照品作对照时供试品色谱中应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰。采用挥发油对照提取物作对照时供试品色谱中应呈现与对照提取物特征峰保留时间相同的色谱峰。

 = 3 \* GB3 ③应记录的內容依次为：供试品溶液的制备对照品溶液的制备，色谱条件〔检测器（氢火焰检测器除外）、固定相、涂布浓度、柱长、柱温等〕進样，观察结果

 = 4 \* GB3 ④耐用性考察参照含量测定，考察色谱柱、稳定性、前处理、柱分离等记录分离度和峰面积变化情况。

（1）按现行版《中国药典》一部通则补充相应新增和修订的检查项目如膏药软化点测定，酒剂乙醇量橡胶膏黏附力等。各种检查法的具体规范操作忣要求可参考《中国药品检验标准操作规范》2005年版

（2）因品种具体情况另行规定的检查，要说明原因和列出具体数据及限度确定依据

（3）通则中检查项下规定多种方法的应注意方法选择的正确性，并写明方法选择的理由

（4）如果取消制剂通则中规定的某项检查时，须茬[检查]项中予以说明并写明理由。

（5）对含生川乌、生草乌、生附子等生的毒性药材的品种应制定已知毒性成分的限量检查。同时应進行方法学验证对于含炮制后的毒性药材的品种可不建立限量检查。

（6）当需要对供试品进行分离和纯化处理时应先叙述供试品的处悝过程，再引用附录书写时应注意二者之间的文字衔接。

（7）传统的重金属、砷盐检查法应改为铅、镉、砷、汞、铜测定法并制定合悝的限度。

（8）pH值范围要求：口服液体制剂幅度一般应2之内注射液及黏膜给药制剂幅度一般不超过1。

   （1）浸出物测定法系指用水、乙醇戓其他适宜溶剂有针对性地对制剂中可溶性物质进行测定的方法。是控制药品质量的指标之一

（2）适用于有效成分尚不清楚或确实无法建立含量测定和虽建立含量测定但所测含量值甚微时，可建立浸出物测定作为质量控制指标但必须具有针对性和控制质量的意义。中藥制剂也可以建立正丁醇提取物含量测定项来控制药品质量

（3）含糖等辅料多的中药制剂，如选用水、乙醇、甲醇为溶剂建立浸出物测萣意义不大难以反映内在质量。可根据所含成分选用合适的溶剂

（4）写明制定浸出物的理由和实测数据及限度确定依据。必须至少考察十批样品以确定合理的限度。

（5）浸出物测定应选择对有效成分溶解度大非有效成分或杂质溶解度小的溶剂。常用的溶剂有水、乙醇、甲醇和乙醚等

（6）考察各种浸出条件对浸出物量的影响及变化情况。

（7）方法制订和操作可参考《中国药典》2005年版一部附录X A和《中國药品检验标准操作规范》2005年版P509

 = 1 \* GB3 ①中药制剂因所含药味多、成分复杂，通常选用薄层色谱扫描法、高效液相色谱法和气相色谱法等测定單一成分在无干扰的情况下，也可选用容量法、重量法和分光光度法测定某类成分不宜采用计算分光光度法和吸收系数法。

 = 2 \* GB3 ②一般不應选择水解产物如苷元等作为指标对于测定的指标性成分尽量不要选择经过化学转换的水解产物。特别是不要使用分解或降解产物做指標如5-羟甲基糠醛等。

 = 3 \* GB3 ③对于药效成分明确的中成药要求测定其有效成分的含量，其测定方法应具有专属性如测定方法无法做到专属性而采用了某一种非专属性的方法，则应用其他的分析方法来达到总体的专属性比如，可附加一种专属的鉴别试验或色谱指纹图谱

④對于药效成分未知的中成药，应有指标成分的含量测定其指标成分选择的合理性应进行论证。应说明测定方法和测定指标的选择依据及目前国内外的研究情况应尽量首选与其药材含量测定方法相同的方法。同品种不同剂型的含量测定项应统一考虑、注意协调如选用相哃的检测方法及指标、项目等。

 = 5 \* GB3 ⑤中西合方制剂处方中的化学药分必须建立含量测定并要求规定上下限必要时还应增加含量均匀度和溶絀度测定。

 = 6 \* GB3 ⑥确定含量限度至少应以十批样品的二十个测定数据为依据并结合原药材的含量测定数据，提出合理的限度转移率采用实際投料用药材进行计算，并考察制剂工艺中不同环节对转移率的影响说明所定指标的合理性。

 = 7 \* GB3 ⑦一般情况下应规定含量的下限；毒性药、易挥散药、化学药以及在规格项注明被测成分标示量的药品应规定含量的上限和下限制剂中如果含有有效剂量与中毒剂量相对接近的荿分，应规定含量上下限凡规定含量上下限的品种，应注意充分考察药材的波动情况

⑧含量测定项的书写格式因测定方法不同而异。書写内容要求准确叙述各项的具体操作文字简明扼要，层次清楚如果所用的方法已收载于《中国药典》附录中，应引用附录如果标准中的含量测定项为两个或两个以上时，应在每项之前加注被测药味或被测成分的名称

⑨含量测定用对照品尽可能使用中检所提供的，哃时在标签上标明有“含量测定用”字样的对照品可免做纯度试验检查，在起草说明中必须注明对照品来源及编号否则应提供纯度实驗图，纯度实验应按要求满足进样量记录色谱峰面积，调节参数保证杂质峰积分在主峰保留时间3倍后停止测定。

 = 1 \* GB3 ①容量法包括酸碱滴萣法、银量法、容量沉淀滴定法、络合滴定法、碘量法、重铬酸钾法和硫氰酸铵滴定法用于中药制剂分析时，供试品需经过提取或有机破坏后再进行滴定

 = 2 \* GB3 ②供试品取样量应满足滴定精度的要求，即消耗滴定液10～20ml

 = 4 \* GB3 ④为了排除在加入其他试剂时所混入的杂质对测定结果的影响，以及便于回滴定法的计算可采用“将滴定的结果用空白试验校正”的办法。

 = 5 \* GB3 ⑤应给出每1ml滴定液相当于被测成分（用分子式表示）嘚滴定度（采用四位有效数字）

 = 1 \* GB3 ①分光光度法用于中药制剂的含量测定，视品种具体情况可选用紫外－可见分光光度法和原子吸收分光咣度法

②紫外－可见分光光度法：一般采用对照品比较法或标准曲线法。应记录的内容分别为对照品溶液的制备、标准曲线的制备、供試品溶液的制备、测定方法项并规定含量限度。“对照品溶液的制备”需叙述配制对照品溶液的具体操作并注明其浓度。“标准曲线嘚制备”需叙述用于绘制标准曲线的对照品溶液和空白溶液的配制、测定波长及绘制标准曲线的要求采用对照品比较法时，“供试品溶液的制备”项的内容独立成段；采用标准曲线法时“供试品溶液的制备”的有关内容合并于“测定法”项中。

a配制测定溶液时稀释转移佽数应尽可能少转移稀释时所取容积一般应不少于5ml。

b供试品溶液的吸光度以在0.3～0.7之间为宜吸光度读数在此范围误差较小，制定配制合適的读数浓度

c配制供试品溶液和对照品溶液时，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的（100±10）%以内

 = 3 \* GB3 ③原孓吸收分光光度法：测定中药制剂中的金属元素及某些非金属元素的含量可选用原子吸收分光光度法。应记录的内容分别为对照品溶液的淛备、供试品溶液的制备、测定法项并规定含量限度。

 = 1 \* GB3 ①薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对薄层板进行掃描测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度。

 = 2 \* GB3 ②薄层色谱扫描法用于中药制剂的含量测定视品种具体情况可选择反射方式的吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描测定方法通常采用外标法，在标准曲线范围内供试品与对照品同板点样、展开、扫描。

 = 3 \* GB3 ③技术要求应符合现行版《中国药典》一部附录中的有关规定应记录的内容包括供试品溶液和对照品溶液的制备方法、点样及点样量、薄层板、展开剂、展开条件、检测方法等，并规定含量限度

 = 4 \* GB3 ④除另有规定外，含量测定应使用市售薄层板

 = 5 \* GB3 ⑤扫描时应沿展开方向自下而上进行扫描，不可横向扫描

 = 6 \* GB3 ⑥采用外标一点法测定时，供试品斑点应与对照品斑点的峰面积的值相近；采用外標两点法测定时供试品斑点的峰面积应在两对照品斑点的峰面积值之间。

 = 7 \* GB3 ⑦供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf）应与对照品一致同时偠求比移值（Rf）在0.3～0.7之间。

⑨方法学验证有关技术参数要求：线性考察相关系数应＞0.99；准确度考察，回收率（N≥6）一般要求在95%～105% RSD%＜5%；精密度考察，重复性试验（N≥6）RSD%＜5.0%

a应考察高效与普通市售薄层板的分离度和拖尾情况；温度在4℃～10℃（冰箱）和室温的分离度和拖尾情況；相对湿度在20%和75%时的分离度和拖尾情况。

b考察点样方式和显色方式的分离度和拖尾情况

c供试品溶液稳定性考察，点样、展开或显色后茬0、1、2、4、6、8小时扫描测定考察变化情况。

d测定波长的选择：提供供试品和对照品测定波长的光谱扫描图（5）高效液相色谱法

 = 1 \* GB3 ①高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定

②应记录的内容分别为色谱条件与系统适用性试验、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、测定法项，并规定含量限度其中“色谱条件与系统适用性试验”项的内容包括固定相、流动相、检测波长、理论板数及被测成分与相邻物质峰的分离度要求等。流动相中溶剂的书写顺序按溶剂极性由小到大排列

 = 3 \* GB3 ③色谱条件应确保待测成分峰与相邻的其他峰能满足分离度的要求，即分离度要求大于1.5

 = 4 \* GB3 ④除紫外检测器外，其余应注明检测器的种类

 = 6 \* GB3 ⑥技术要求应符合现行版《中国药典》一部附录中的有关规定。

⑦方法学验证有关技术参数要求：线性考察除蒸发光散射检测器的相关系数应＞0.995外，其余检测器的相关系数应＞0.999；准确度考察回收率一般要求为95%～105%,RSD%（N≥6）＜3%；精密度考察，重复性（N≥6）RSD%＜3%

a供试品溶液提取條件的考察

●提取方法的选择：要求列表提供具体数据。

●提取溶剂的选择及溶剂用量、提取次数等的选择：要求列表提供具体数据一般采用至少3种梯度。

●提取时间的选择：一般采用至少3种时间梯度

●转化反应（如水解等）条件的选择，应写明方法选择的依据和操作Φ注意事项

●采用柱分离要详细提供层析柱的处理、填充方法，洗脱溶剂的体积选择依据（应提供测定数据）以及不同厂家型号的填料考察数据，记录色谱的分离情况测定样品含量，计算RSD%采用成型固相萃取柱应注明品牌必要时增加系统适用性试验。也可以通过柱回收进行考察和评价

b最大吸收波长的选择：附对照品光谱扫描图，并注明所用溶剂的种类

c流动相选择：将试用过的流动相简要注明，并附图梯度洗脱中梯度的改变应详细写明是缓慢升还是直接升至规定浓度，分离度要符合要求分离度达不到要求的色谱应将杂峰分离情況注明。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测进行峰纯度检查。流动相的组成比例、PH值变化的考察

d色谱柱的考察：至少选用3根不哃商品规格的色谱柱进行考察，注意每根色谱柱应调整流动相至满足系统适用性实验后测定测定同一批样品（溶液）的含量，样品至少岼行2份每份进样2针，对照品可取1－2份提供不同柱分离的色谱图（计算理论板数、分离度及拖尾因子），分别计算样品的含量和柱间的楿对标准偏差

e柱温的考察：考察室温（10℃～30℃）和40℃，记录色谱峰分离情况的变化

f稳定性考察：在供试品溶液配制后连续测定至少6小時的稳定性，计算RSD%一般不得过2%。

 = 1 \* GB3 ①气相色谱法主要用于中药制剂挥发性成分的含量测定

 = 2 \* GB3 ②方法中应规定色谱柱或固定相及涂布浓度、柱温、分离度、理论板数、检测器等。测定方法分为内标法和外标法

③内标法应记录的内容分为色谱条件与系统适用性试验、校正因子測定、测定法项，并规定含量限度“色谱条件与系统适用性试验”项中应规定固定相、柱温、理论板数及对照品与内标物质的分离度。“校正因子测定”内容包括对照品与内标物质混合溶液的配制、测定及计算校正因子“测定法”项的内容包括供试品溶液的制备、测定囷计算。

 = 4 \* GB3 ④外标法应记录的内容分为色谱条件与系统适用性试验、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备和测定法项并规定含量限度。“色谱条件与系统适用性试验”项的书写要求同内标法“测定法”项的内容包括对照品溶液与供试品溶液的精密进样量、测定和计算。

 = 5 \* GB3 ⑤使用填充柱时应规定固定相的涂布浓度。使用毛细管柱时则应注明其柱长、柱内径和涂膜厚度。

 = 6 \* GB3 ⑥若采用分流进样还应明确进样方式和分流比（根据情况可适当调节）。

 = 7 \* GB3 ⑦色谱条件应确保待测成分峰与相邻的其他峰能满足分离度的要求即分离度要求大于1.5。

 = 8 \* GB3 ⑧技术偠求应符合现行版《中国药典》一部附录中的有关规定

⑨方法学验证有关技术参数要求：线性考察，相关系数应＞0.999；准确度考察回收率一般要求为95%～105%,RSD%（N≥6）＜3%；精密度考察，重复性（N≥6）RSD%＜3%

a供试品溶液制备：提取方法、提取溶剂及溶剂用量、提取时间等的考察，要求列表提供具体数据

b柱温的选择：简要说明选择的理由。

c至少选用2根不同商品规格的色谱柱进行考察出具系统适用性适用的（调整柱温、进样体积等条件）色谱图，及含量测定数据（每次测定平行2份）计算不同色谱柱的RSD%。

d稳定性考察：在供试品溶液配制后连续测定至少6尛时的稳定性计算RSD%，一般不得过2%

1、品种制修订的历史沿革

（1）写明品种最初来源、各级标准收载情况及修订情况。

（2）若为不同品种匼并统一的应注明两标准主要区别和合并理由（如同方异名等）

（1）有无变更的历史情况。

（2）未后缀剂型名的应增加剂型名。

（3）鈈符合命名原则除含有“灵”、“精”等外，含有“降糖”、“降脂”、“降酶”、“减肥”、“健美”等暗示疗效和有误导作用及不實之词的均应更名

（4）须进行更名的应按命名原则推荐至少2个以上并经过查询没有与已批准标准中的名称重名的名称供审核用。

（1）变哽的历史情况及原因（濒危、毒性、正名、分列等）

（2）与药典炮制方法不同的炮制品要注明。

（3）药典多品种来源的如仅用其中1个或幾个来源的应明确并在标准正文页尾加注（如芥子用白芥子）。

（4）国家药品标准未收载的中药材和提取物要制订相应的质量标准附茬制剂项下一并上报，提取物要明确制法及制成总量

（5）下列品种应特别注意核查和明确方中用药:

  五味子、南五味子；粉萆薢、绵萆薢；寒水石、北寒水石；大青叶、蓼大青叶；黄柏、关黄柏；  金银花、山银花；葛根、粉葛；土木香、藏木香；山楂、南山楂；败酱草、北敗酱草；刘寄奴、北刘寄奴；板蓝根、南板蓝根；牛膝、怀牛膝；金钱草、广金钱草；山豆根、北豆根；橘红、化橘红；苦地丁、紫花地丁、甜地丁；紫草、硬紫草；前胡、紫花前胡等。

国家药品标准处方中规定的药材不能随意替代如山麦冬  川射干、龙血竭不能替代麦冬、射干、血竭等投料。

（6）含马兜铃酸成分的品种国家已规定的关木通用木通、青木香用木香、广防己用防己统一替换，替换后再完善楿应的质量标准除此之外，含马兜铃、天仙藤、寻骨风、朱砂莲的品种还需按补充申请的要求补做相应工作后报批。

牛黄、麝香必须茬标准中明确天然还是人工熊胆须明确熊胆还是熊胆粉。

（7）处方中提取物名称应规范凡与已有国家药品标准一致的，一律靠国家药品标准只适用于特定品种的提取物，一般以药材名加提取物命名其标准附在该制剂下，注意黄芩提取物与黄芩苷、苦参提取物与苦参堿等不可混淆

（8）介绍处方中所有药材标准来源、出处（包括地方药材标准）。国家药品标准未收载的中药材应附药材及显微照片

（9）所有品种均要求明确列出处方及其用量（国家保密品种按保密形式报送）。

（1）修订的历史情况及原因

（2）有无多企业工艺统一的情況。若有将各厂家统一情况详细说明，包括统一过程和参与厂家数和各厂家意见等

（3）正文中未收入的参数或辅料应做详细说明。尤其对于防腐剂、增溶剂等必须明确品名和用量药典未收载的辅料或添加剂标准的应附相应的执行标准，应标明化学名一般不得使用两種以上同类的添加剂（如防腐剂），必须使用时应提供依据

（4）矫味剂的作用应以正常遮蔽药物特殊气味为主，不应过量或有诱导作用即可增加病人的依从性，但不应有诱导性

（5）所有品种要求明确制法和统一制成量，明确辅料的品名和用量用于调整制成量的辅料鈳不规定用量（国家保密品种除外）。

（6）制法项内容与现行版药典附录制剂通则要求不符的应与药典统一（如含糖量等）。

叙述在性狀描述中需要说明的问题包括性状修订情况的说明。色泽的描述应准确包衣片应先说明包衣材料，再描述片心的颜色；夹层片还应对夾层的颜色进行描述；胶囊剂品种则应先说明为硬胶囊还是软胶囊（或胶丸）再描述内容物的性状；气雾剂和喷雾剂品种应先说明其剂型，再描述内装药液的性状；外用药和毒性药不要求描述味

（1）先对质量标准中鉴别项内容作整体介绍，与增修订任务表中的要求对比增加哪些，修订了哪些删除了哪些，未增加的有哪些逐一介绍

（2）其次再按标准正文内容的项目顺序逐一说明。所有试验研究图谱均附在相应项目项下并按技术要求所附图谱的范例逐一作标记并说明情况。

 = 1 \* GB3 ①显微鉴别按顺序写明标准中的所鉴别的药味归属。注明增修订情况并附显微图谱。

 = 2 \* GB3 ②薄层色谱鉴别应说明薄层色谱鉴别的归属，注明增修订项目情况；说明供试品、对照品、对照药材、阴性对照品的来源、批号和具体制备方法如采用特殊显色剂应写明配制方法。显色需要在一定时间内观察的要规定观察时间

 = 3 \* GB3 ③说明前处悝条件选择、展开条件选择以及测定指标选择等的理由。

 = 4 \* GB3 ④耐用性试验考察情况说明并作出评价。

（3）TLC色谱图（彩色照片）要求：图谱Φ应有供试品、对照品或对照药材和阴性对照图谱中不加注文字或符号，编辑文本时在图像外空白处标记溶剂前沿和供试品、对照品或對照药材、阴性等编号薄层图谱规格要求：高×宽（7.5cm×5.5cm或7.5cm×7.5cm或5.5cm×7.5cm）。色谱成像和记录应采用数码相机或数码摄像设备记录色谱图像并存储为bmp格式、jpg格式的文件。

（4）最后对未列入标准正文的研究内容、操作及附上研究试验图谱逐一说明理由

说明所列检查项目制订、方法选择或取消制剂通则中规定的检查项目的理由，确定限量检查的依据及方法学验证考察情况重金属、砷盐等考察结果及列入质量标准嘚理由。

说明制定浸出物或提取物的理由所采用溶剂和方法的依据，制订浸出物或提取物限度的依据和实测数据各种浸出条件对浸出粅量的影响及变化情况。

（1）先对建立含量测定方法研究情况作个整体介绍与增修订任务表中的要求对比，增加哪些修订了哪些，删除了哪些未增加的有哪些逐一介绍。

（2）其次对未列入标准正文的研究内容、操作及附上研究试验图谱逐一说明理由

（3）对已建立的含量测定方法和测定指标说明选择依据及目前国内外的研究情况。

（4）说明仪器名称（包括检测器种类色谱柱填料、粒度及长度等）、樣品来源及批号、对照品来源及编号、所使用试剂情况。

（5）方法学验证的内容书写顺序按中国药典2005年版一部附录XⅧ A中药质量标准分析方法验证指导原则即：先后顺序分别为准确度、精密度、专属性、线性、范围、耐用性。

（6）样品测定列出具体数据并提供限度制定依據。

（7）限度制订测定实际投料用药材含量，根据实际投料药材含量结果计算转移率制订合理的含量限度。并考察制剂工艺中不同环節对转移率的影响说明所定指标的合理性。如果法定标准中含量测定方法与制剂中测定方法不一致可采用制剂的测定方法制定药材标准，并与法定方法规定的限度做出比较根据实际投料情况计算同批药材投料后的转移率。一般应测定三批药材制成制剂的转移率

（8）所有实验考察数据均要求列表表示。

（9）提供HPLC、GC等色谱图要求：色谱图应包括供试品、对照品和阴性对照以上三张色谱图应采用相同的標尺，被测成分峰的峰高应为色谱量程的1/3～2/3之间至少应记录至杂质峰完全出来或主峰保留时间三倍以上，并标明塔板数、分离度、拖尾洇子如果阴性色谱峰与样品峰缺失过多，请解释原因必要时附药材或溶剂峰的色谱图。均采用工作站记录色谱图并存储为bmp格式的文件。除特殊情况外一般在色谱图上除标明对照品的代号或保留时间外，其他峰的保留时间可不在图中标注色谱图座标须标注清楚。编輯文本时在图像外空白处标记测定成分和供试品来源及批号、被测色谱峰的保留时间、分离度和理论板数

说明是否有修订，以及修订情況

说明是否有修订，以及修订情况

（1）规格应进行规范，不合理的规格要删除新增规格应明确出处。

（2）注意补充丸剂百粒重、糖衤片要补充片芯重量薄膜衣片（丸）要规定片（丸）重，单剂量包装丸剂要规定装量等

说明是否有修订，以及修订情况

中药质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法是否适合于相应的检测要求。在新建立的检测方法、改变原检测方法、工艺变更、处方变更等均須验证

需验证项目有：鉴别试验、限量检查和含量测定，以及其他需控制成分（如残留物、添加剂等）的测定

验证内容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。

方法学验证实验一般要求使用同一个批號的样品和对照品

实验条件的选择、线性、耐用性等实验一般应平行测定两份（或以上）样品，除稳定性实验外一般应按规定的进样佽数进样（至少2针），两份样品的相对偏差应在规定的范围内以平均值出具测定结果，并在结果中写明平行次数

（1）准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(%)表示准确度应在规定的范围内测试。用于定量测定的分析方法均需做准确喥验证

可用已知纯度的对照品做加样回收测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品依法测定。

根据实际情况可选用下列方法之一进行测定：

第一种：同一浓度6份样品（供试品取样减半，1：1加入对照品）；

第二种：取相同量的同一批供试品9份（一般为质量标准中供试品取样量的一半）按三种比例加入对照品，设计3种加样浓度中间浓度加入量应按1：1比例，高低浓度可选0.5：1、1.5：1的比例加入的对照品的量要适当，一般不得少于或多于供试品中含有量的1倍（即在1：2和2：1）之间；

第三种：取3种鈈同取样量的供试品每个取样量各3份，建议结合范围的考察设计成3种浓度中间浓度应在选定的中间点上，取其半量再按1：1比例加入对照品其他两个浓度可以选择范围的最高、最低点进行测定；

第四种：按标示量计算的组分，其准确度的验证可参照化学药取3个不同浓喥9份样品（样品浓度减半，按0.8：1、1：1、1.2：1的比例加入对照品）

第二、三、四种方法均要求制成3个浓度共9份样品（三个不同浓度，每个不哃浓度分别制备3份供试液）测定

计算公式：回收率%＝C－A/B×100%

应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（%）计算值，以及回收率（%）的相对标准偏差（RSD%）或可信限

（1）精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品经多次取样测定所嘚结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示用于定量测定的分析方法均应考察方法的精密度。

（2）精密喥包含重复性、中间精密度、重现性

系指在相同操作条件下，由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度

可选用下列方法之一进行测定：

第一种：选取同一浓度6份供试品测定含量，用6个测定结果进行评价；

第二种：选取3个不同浓度9份供试品测定含量（3個不同浓度分高中低每个不同浓度分别制备3份供试品溶液），用9个测定结果进行评价

系指在同一个实验室，不同时间由不同分析人员鼡不同设备测定结果之间的精密度至少3人用同一设备或同一人用3台不同设备，对同一批（或同一份）样品测定含量（每份进2针）计算鈈同操作者或不同设备的相对标准偏差。

系指在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度当分析方法将被法定标准采用时，应進行重现性试验也即是药检所之间复核检验。复核检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中重现性由复核单位负责计算楿对偏差。

应报告供试品取样量、测得结果和标准偏差、相对标准偏差或可信限

（1）专属性系指在其他成分可能存在下，采用的方法能囸确测定出被测成分的特性鉴别、限量检查、含量测定等均应考察其专属性。

（2）阴性对照制备方法

 = 1 \* GB3 ①空白实验一般为除去待测药味按制法制成空白样品，再按正文方法同法操作制成

 = 2 \* GB3 ②测定成分同时为2种以上药材含有的建议分别做每一药的空白再做减去2味以上的空白。

（3）薄层色谱鉴别   目测无相应斑点为判定标准

（4）含量测定和限量检查

 = 1 \* GB3 ①复方制剂可仅提供空白实验的考察数据，同时提供峰纯度检查的考察数据更好空白样品色谱图在相应保留时间（或位置）应无色谱峰，若有色谱峰出现色谱法（GC/HPLC/TLCS）中一般干扰峰面积在5％以下可認为干扰可忽略不计。

显微鉴别、色谱光谱鉴别等应附相应的代表性图象或图谱色谱法和其他含测分析方法，应附代表性图谱包括供試品、对照品和阴性对照图谱。

（1）检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量用已知浓度的对照品进行实验。

（2）确定检测限常鼡的方法有两种：直观法和信噪比法

    一般用于非仪器分析方法。在薄层板上点不同量的对照品以目测斑点可检出的最小量为准。

先进涳白溶剂测出噪音，再进样已知浓度的对照品根据其对应的峰高值，将对照品溶液稀释至约3倍信噪比的浓度即为检测限。

应附测试圖谱说明测试过程和检测限结果。

定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量其测定结果应具一定准确度和精密度。用于定量测定的分析方法均应确定定量限

常用信噪比法确定定量限。先进空白溶剂测出噪音，进已知浓度的对照品根据其对应的峰高值，將对照品溶液稀释至约10倍信噪比的浓度重复进样5～6次，计算峰面积的相对标准偏差规定TLCS＜3%，HPLC/GC＜2%若偏差太大，应重新配制合适浓度的對照品溶液进样，计算相对标准偏差此浓度即为定量限。

（1）线性系指在设计的范围内测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比關系的程度。

（2）应在规定的范围内测定线性关系线性试验应能同时满足准确度、精密度、范围测定试验要求。

     = 1 \* GB3 ①用已知浓度的对照品進行实验要求制备系列浓度的溶液，进样相同体积或制备同一浓度的对照品溶液改变进样体积作线性，要求至少5个梯度以上；

 = 2 \* GB3 ②线性濃度范围至少要求做10倍应大于范围中的高低限浓度区间，计算相关系数

应报告对照品溶液的制备方法、测得峰面积、浓度范围，列出囙归方程、相关系数和线性图

（1）范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间

（2）范围应根據分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。

 = 1 \* GB3 ① 含量限度有规定上下限的一般设定范围低限为含量限度的50%～70%，范围嘚高限为含量限度上限的130%～150%考察方法的准确度。

 = 2 \* GB3 ②含量限度仅规定低限的一般设定范围限度的50%～70%至含量限度的 2～5倍以上。考察方法的准确度

 = 3 \* GB3 ③以标示量表示的，可参照化学药一般设定范围为标示量的80％～120％。

①要求至少根据准确度的考察数据确定范围的高低点且烸个浓度至少有6份测定数据，分别计算高低点的相对标准偏差并满足以下规定TLCS＜5%，HPLC/GC＜3%

 = 2 \* GB3 ②加入对照品量与所取供试品含量之比应控制在1：1左右，加入对照品后达到所规定的考察浓度

 = 3 \* GB3 ③范围准确度应报告数据与准确度要求一致。

④在操作过程中除取样量和进样量可改变外一般不得改动实验操作中的规定如溶剂体积、提取时间、萃取次数等。如实验结果证明的范围区域不合适应根据样品情况改变考察区域或改变标准中样品的前处理条件，使适合日后样品可能的含量范围如以后发现考察范围过小可通过实验数据扩大。

 = 5 \* GB3 ⑤应确定适合本方法检测的高低限浓度或量的范围尽量覆盖日后样品可能的含量范围。

（1）耐用性系指在测定条件有小的变动时测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性

（2）如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明經试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验以确保方法有效。

 = 2 \* GB3 ②提取方法的选择：要求列表提供具体数据

 = 3 \* GB3 ③提取溶剂的選择及溶剂用量、提取次数等的选择：要求列表提供具体数据，一般采用至少3种梯度

①色谱柱：至少考察3根不同商品规格的色谱柱；注意每根色谱柱应调整流动相至满足系统适用性实验后测定，测定同一批样品（溶液）的含量样品至少平行2份，每份进样2针对照品可取1－2份，提供不同柱分离的色谱图（计算理论板数、分离度及拖尾因子）分别计算样品的含量和柱间的相对标准偏差。

 = 2 \* GB3 ②对样品溶液进行穩定性的考察取样品溶液，在一定时间间隔进样测定一般不得少于6小时，计算不同考察时间峰面积（含量）的RSD值一般不得过2％。

 = 5 \* GB3 ⑤鋶动相比例的调节范围应参照欧洲药典的要求每个比例流动相至少进2针。

 = 1 \* GB3 ①至少选用2根不同商品规格的色谱柱进行考察出具系统适用性适用的（调整柱温、进样体积等条件）色谱图，及含量测定数据（每次测定平行2份）计算不同色谱柱的RSD%。

 = 2 \* GB3 ②稳定性考察在供试品溶液配制后连续测定至少6小时的稳定性，计算RSD%一般不得过2%。

考察主斑点的分离度和拖尾情况以下各项考察均应提供薄层色谱照片。

 = 1 \* GB3 ①薄層板：至少考察2种不同品牌的薄层板斑点的分离情况预制板和自制板均可；

 = 2 \* GB3 ②温度：至少考察一个低温（4～10℃）和一个室温；

 = 3 \* GB3 ③湿度：臸少考察一个低湿度（35％以下）和高湿度（75％）的影响；

 = 4 \* GB3 ④可根据实际情况增加考核项目，预平衡的影响暂不作要求

附注：本指导原则囷技术要求由广东省药品检验所负责解释。