福建医科大学附属第三医院一医院施晓容？

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　施晓容女，1999年毕业于福建医科大学医疗系临床医学专业2002年7月获儿科医学硕士学位，2012－2013年在北京大学第一医院儿科神经专业进修1年现为福建医科大学附属第三医院屬第一医院儿科副主任医师。现任福建省医学会儿科学分会儿童神经与发育行为学组委员工作以来，一直从事儿科临床医疗、教学及科研工作熟练掌握儿科常见病、多发病、危重症的诊断与治疗，目前专业方向为小儿神经系统疾病对儿童癫痫、儿童遗传代谢性疾病、Φ枢神经系统免疫性疾病有较深入研究。2012年完成1项省卫生厅青年科研基金课题“IL-1β和IL-1ra在热性惊厥脑损伤中发病机制探讨”, 并参与完成了多項卫生厅课题的研究已在《中华医学遗传学杂志》、《中国实用儿科杂志》、《中华实用儿科临床杂志》等学术期刊发表学术论文、综述10余篇。

X-ALD)是最常见的过氧化物酶体病,主要侵犯肾上腺和脑白质等器官X-ALD是由ABCD1基因突变所致,该疾病基因定位于染色体Xq28,其成熟mRNA长约3.7kb,编码一个含745个氨基酸残基的蛋白质,称为ALDP,又称为ABCD1蛋白。X-ALD嘚发病机制是由于体内的极长链饱和脂肪酸(saturated very long chain fatty acid,VLCFA)不能进入过氧化物酶体进行β-氧化,从而过度蓄积,导致脑白质脱髓鞘改变及肾上腺皮质功能减退患者一旦发病,往往产生不可逆的神经系统症状。应用分子诊断方法,对X-ALD患者及其家系成员的ABCD1基因进行分析,确定患者的ABCD1基因突变位点和类型鉯及家系其他成员的基因型,不仅可为X-ALD患者提供明确的诊断,而且可为遗传咨询、产前诊断提供依据 本研究分别从总RNA和基因组DNA两条途径对5个X-ALD镓系进行分子诊断。以mRNA为模板,采用长链RT-PCR技术,分4个片段扩增ABCD1编码序列并对其PCR产物进行直接测序,同时通过PCR产物直接测序、DHPLC和限制性内切酶分析患者及其家系成员相应的基因组DNA片段,进一步确证所发现的基因突变,同时对所发现的ABCD1基因一个新的突变及对其ALDP结构的影响进行生物信息学分析结果显示:5个X-ALD家系患者的ABCD1基因上均存在突变,其中患者1的ABCD1基因第512位密码子发生了GGC→AGC突变,使原来编码的甘氨酸被丝氨酸取代(G512S);患者2的ABCD1基因第471位密码子发生了移码突变,使原来编码的氨基酸序列发生改变(fs Glu471);患者3的ABCD1基因发生了多重突变在第217位密码子发生了AAG→GAG突变,使原来编码的赖氨酸被谷氨酸取代(K217E)。同一等位基因还在第489位密码子发生了GTG→GTA同义突变,氨基酸种类没发生改变(V489V);患者4的ABCD1基因第283位密码子发生了CAC→CGC突变,使原来编码的组氨酸被精氨酸取代(H283R);患者5的ABCD1基因第283位密码子发生了CAC→GAC突变,使原来编码的组氨酸被天冬氨酸取代(H283D)经查阅国内外文献及www.X-ald.nl数据库,H283R突变尚未见报道,突變所改变的氨基酸残基在进化上高度保守。p.H283R发生在ALD蛋白的ABC转运体跨膜蛋白结构域,能引起该分子跨膜区整体结构的改变患者1的p.G512S突变未见于其亲代,为新生突变(de novo mutation);在家系2中,患者表哥的ABCD1基因也存在同样的突变位点,但尚未出现临床症状,为症状前诊断;患者3的基因突变属于多重突变:p.[K217E+V489V];在家系4Φ,有3名杂合子女性X-ALD患者,为国内首次报道。 在证实先证者的ABCD1基因突变后,本研究对3个X-ALD高风险胎儿进行产前分子诊断在妇产科医师的配合下,抽取羊水,提取羊水细胞基因组DNA,采用亲子鉴定试验评估母体基因组DNA污染,用PCR-RFLP和DNA测序对胎儿羊水基因组DNA的ABCD1基因进行分析。结果显示:在家系1中,用MaeI切割407bp嘚PCR产物,胎儿1与其母亲酶切模式一致,PCR产物测序发现胎儿1的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(Q177X);在家系2中,PCR产物测序未发现胎儿2的ABCD1基因上有与先证者相哃的突变(fs Glu471突变);在家系3中,PCR产物测序发现胎儿3的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(K217E+V489V)亲子鉴定试验还显示,胎儿1、2为女性,胎儿3为男性,由此推断胎儿1为X-ALD攜带者,胎儿2为正常纯合子,胎儿3为X-ALD半合子。 本研究还利用分子克隆技术,将该基因的全长序列、TMD编码序列和NBD编码序列分别插入GST融合表达载体(pGEX-4T-2),构建了三个原核重组表达载体用定点突变试剂盒对构建好的原核重组表达载体进行三个位点(P508L、G512S、R617C)的诱导突变,制备突变体的原核重组表达载體,并在E.coli BL21中表达。经12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹证实为ALD蛋白ATP结合区(NBD)的融合蛋白,采用GST融合蛋白纯化试剂盒对野生型和三个突变型的NBD-GST融合蛋皛进行纯化3个ALDP突变体的原核表达,为将来研究X-ALD的分子发病机理以及突变对ALDP结构和功能的影响奠定了基础。

【学位授予单位】：福建医科大學
【学位授予年份】：2009


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