专利名称：：作为昆虫控制剂的dsrna嘚制作方法
：一般而言本发明涉及对有害生物(pest)侵袭的遗传学控制。更具体地本发明涉及双链RNA重组技术，用于阻遏或抑制有害生物中靼編码序列的表达导论环境中充满有害生物，人们已经试图^f吏用多种方法来控制有害生物对植物的侵袭用于控制显微有害生物侵袭的组匼物已经以抗生素、抗病毒和抗真菌组合物的形式提供。通常用于控制较大有害生物(例如，线虫)侵袭的方法是化学组合物的形式其被應用于有害生物驻留的表面，或者以小丸、散剂、片剂、糊剂或胶嚢剂的形式施用给受^:袭的动物商业作物通常是昆虫攻击的目标。过去數十年来已经做出了相当的进展开发出了更高效的方法和组合物用于控制植物中的昆虫侵袭。化学杀虫剂对于根除有害生物侵袭非常有鼡然而，使用化学杀虫剂有若干种缺点化学杀虫剂有可能对于环境有害，而且化学杀虫剂还不是选择性的，其对于多种作物和非靶標动物群体同样有害化学杀虫剂持续存在于环境中，通常代谢得很慢(如果有代谢)它们在食物链中积累，特别是高等食肉动物物种中這些化学杀虫物质的积累导致对这些物质抗性的发展，并且可能在进化梯中高等的物种中成为诱变剂和/或致癌物，导致不可逆的和有害嘚遗传修饰因为与化学杀虫剂相关的这些危险，已经开发了分子手段来控制植物上的有害生物侵袭例如，苏云金芽孢杆菌(必""'//附^"/7>^&朋&)(B.t.)细菌巳经可商业获得其在超过三十年来用作为环境安全的、可接受的杀昆虫剂。化学杀虫物质应用的减少已经产生了更干净的土壤以及从從土壤流入周围溪流、河流、池塘和湖泊的更干净的水。除了这些环境益处之外由于化学杀昆虫物质使用的减少，在生长转基因昆虫抗性作物的作物田间有益昆虫数量也显著增加了。RNA干扰(RNAi)提供了用于控制基因表达的潜在的强大工具因为其能特异性靶向选捧，并且以显著高的效率进行靶向mRNA遏制RNAi指通过短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默(Zamore，P.等人O//101:25-33(2000);Fire,A.等人，391:806(1998);Hamilton等人,286950-951(1999);Lin等人，A^""402:128-129(1999))虽然RNAi的机制还没有获得完全表征，但是人们认为细胞中dsRNA的存在通过激活核糖核酸酶III切酶来触发RNAi(Zamore，P.等人(2000);Hammond等人7V"/m"404，293(2000))切酶将的dsRNA加工为短片段，其被称为短干扰RNA(siRNA),其为大约21至夶约23个核苦酸长包含约19个>^^"双链体(231110^等人，(2000);Elbashir等人Z)ev.，15188(2001))。递送进细胞后siRNA分子与内切核酸酶复合物相关联，该复合体通常被称为RNA诱导性沉默複合物(RISC),其将siRNA的反义链和细胞mRNA基因耙带到一起RISC切割mRNA，然后所述mRNA释放并被降解重要地，然后RISC能降解粑mRNA的额外拷贝因此，本发明提供了通過阻遏、延迟或降低特定有害生物中的基因表达来控制有害生物侵袭的方法和组合物
发明内容在一个方面，本发明提供了经分离的核苷酸序列其包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、、2461、2466、2471、2476和2481中示出的核酸序列。在一种实施方案中本发明提供了双链核糖核苷酸序列，其是多核普^列的表达产生的其中，植物的囿害生物才聂入所述核糖核苷酸序列能抑制所述有害生物的生长在又一实施方案中，才l^所述序列抑制与所述序列充分互补的核苷*列的表達在另一实施方案中，用该多核苷酸转化细胞在还一实施方案中，用该多核苷酸转化植物或植物细胞在又一实施方案中，从经转化嘚植物产生种子或产品在再一实施方案中，产品选自食品、饲料、纤维、纸、餐食、蛋白质、淀粉、面粉、青贮饲料、咖啡、茶和油构荿的纟且在另一实施方案中，本发明提供了与SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621—767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481中的任何序列示出的核紗列具有至少70/。序列同一性的核苷酸序列在一种实施方案Φ，本发明提供了双链核糖核普酸序列其是多核苷酸序列的表达产生的，其中植物的有害生物摄入所述核糖核苷酸序列能抑制所述有害生物的生长。在又一实施方案中a/v所述序列抑制与所述序列充分互补的核苷酸序列的表达。在另一实施方案中用该多核苷酸转化细胞。在还一实施方案中用该多核苷酸转化植物或植物细胞。在又一实施方案中从经转化的植物产生种子或产品。在再一实施方案中产品选自食品、饲料、纤维、纸、餐食、蛋白质、淀粉、面粉、青贮伺料、咖啡、茶和油。在另一方面本发明提供了包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸的基因的直向同源物。在一种实施方案中本发明提供了双链核糖核苷酸序列，其是多核苷酸序列的表达产生的其中，植物的有害生物摄入所述核糖核苷酸序列能抑制所述有害生物的生长在又一实施方案中，摄入所述序列抑制与所述序列充分互补的核苷酸序列的表达在另一实施方案中，用该多核苷酸转化细胞在还一实施方案中，用该多核苷酸转化植物或植物细胞在又一实施方案中，从经转化的植物产生种子或产品在再一实施方案中，产品选自食品、饲料、纤维、纸、餐食、蛋白质、淀粉、面粉、青贮饲料、咖啡、茶和油在另一个方面，本发明提供了包含源自有害生物物种的双链核糖核酸序列的植物在一种实施方案中，有害生物选自昆虫、蜘蛛类、曱壳类、真菌、细菌、病毒、线虫、扁形动物、蛔虫、蛲虫、钩虫、绦虫、锥虫、血吸虫、狂蝇、跳蚤、壁虱、螨和虱在另一实施方案中，植物;U&质雄性不育的在另一实施方案中，序列能抑制有害生物的生物学活性在另一实施方案中，序列能抑制靼序列的表达在又一实施方案中，乾序列是昆虫、线虫、细菌或真菌序列在另一个方面，本发明提供了控制有害生物侵袭的方法所述方法包括向有害生物提供植物材料，所述植物材料包含能抑制有害生物生物学活性的多核苦酸序列在一种实施方案中，所述多核苷酸序列是SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49一158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621_767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、、,2461、2466、2471、2476和2481中的任何序列或其互补序列示出的在另一个方面，本发明提供了包含表达耙多核苷酸序列的植物的杀虫剂在另一个方面，本发明提供了一种方法用于控制有害生物侵袭，所述方法包括(a)鉴定出有害生物中的靼序列；(b)将所述序列引入植物；以及(c)向所述有害生物提供所述植物或其部分在另一个方面，本发明提供了一种方法用于控制有害生物侵袭，所述方法包括(a)鉴定出第一有害生物物种Φ的把序列；(b)搜索出第二有害生物物种中的直向同源耙序列；(c)将所述直向同源序列引入植物；以及(d)向所述第二有害生物提供所述植物或其蔀分在另一实施方案中，所述耙是来自马铃薯叶甲(L)的基因所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、馫蕉、大麦、菜豆、甜菜(beet)、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜(canola)、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、,菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜(endive)、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶45^杉(gumhemlock)、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芹、歐洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物(peat)、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫芦、菊苣(radicchio)、萝卜、油菜(rapeseed)、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔(tangerine)、茶、烟草、番茄、树、黑尛麦、草坪草、芜青、芟生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜。在另一个方面本发明提供了一种方法，用于提高作物产量所述方法包括U)向植物中引入多核苷酸；以及(b)种植所述植物，以令多核普g达其中，所ii^达抑制有害生物进食(feeding)以及由于有害生物侵袭导致的产量损失在一种实施方案中，所述有害生物选自昆虫、线虫和真菌在另一实施方案中，多核苷^达产生下述RNA分子其能在摄叺了所述作物植物的一部分的昆虫有害生物中遏制下述靶基因，其中所迷耙基因执行选自以下的至少一种重要功能有害生物进食、有害苼物生存能力(viability)、有害生物细胞凋亡、有害生物或任何有害生物细胞的分化和发育、有害生物的有性繁殖、肌肉形成、肌肉颤搐、肌肉收缩、保幼激素形成和/或降低、保幼激素调节、离子调节和转运、细胞膜电位保持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素感知、触角形成、翅膀形成、腿形成、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴保持、神经传递、幼虫期转换、蛹化、从蛹化出现、细胞分裂、能量代谢、呼吸、细胞骨架结构合成和保持、核苷酸代谢、氮代谢、水的使用、7JC驻留和感知。在另一个方面夲发明提供了一种方法，用于生产商品产品所述方法包括(a)鉴定出有害生物中的耙序列；(b)将所述序列引入植物细胞；(c)在适于产生植物的条件下培养所述植物细胞；以及(d)从所述植物或其部分来生产商品产品。在另一实施方案中所述靶是来自马铃薯叶甲的基因，所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、垮梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜(beet)、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、咁蓝、卡诺拉油菜(caiiola)、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、芹菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜(endive)、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉(gumhemlock)、山核桃、羽衣咁蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧开、欧洲防风草、豌豆、书匕、花生、梨、沼泽植物(peat)、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫芦、菊苣(radicchio)、萝卜、油菜(rapeseed)、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向曰葵、甘薯、甜玉米、红桔(tangerine)、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜在另一实施方案中，所述耙是来自辣根猿叶甲(P.coc/ife"n'fle)的基因所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天門冬、垮梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、芽菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫,、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草碎草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜。在另一实施方案中所述耙是来洎墨西哥豆瓢虫(Ev"nV幼、)的基因，所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、芹茱、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芽、欧洲防风草、豌豆、桃、花苼、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫声、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草冲草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜在另一实施方案中，所述耙是来自墨西哥棉铃象(A)的基因所述植物选自金合歡、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、芹菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、扛豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫芦、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜。在另一实施方案中所述靼是来自赤拟谷盗(r.cas似we"附)的基因，所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、膤松、谷类、萍菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、來檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫芦、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜在另一实施方案中，所述靶是来自桃蜱(M/7em'aie)的基因所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、齐菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芽、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植粅、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫芦、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、雲杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番痴、树、黑小麦、草坪草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜。在另一实施方案中所述靶是来自褐飞虱(TV./"^"s)的基因，所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、,菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核书匕、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫芦、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玊米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草碎草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜在另一实施方案中，所述乾是来自二化螟(C.SW/7/7"M"fe)的基因所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鲟梨、香蕉、大麦、菜豆、憇菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、芽菜、栗、樱、夶白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧萍、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫声、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、嫼麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜。在另一实施方案中所述耙是来自菜蛾(户.J9，/Mte//"的基因所述植物选洎金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、齐菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、肛豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衤甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫,、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草扦草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、紅豆杉和夏南瓜。在另一实施方案中所述靼是来自居屋艾蟋(A^we幼'c"s)的基因，所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、芹菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴馫、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芽、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫芦、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜在另一实施方案中，所述耙是来洎真菌的基因所述植物选自金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、芹菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏尛柑橘、三叶草、咖啡、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧萍、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫芦、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草畔草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜。在另一实施方案中本发明提供了经分离的核苷酸序列、双链核糖核苷酸序列、细胞、植粅或产品用于处理植物的昆虫侵袭的用途。在另一实施方案中本发明提供了经分离的核苷酸序列、双链核糖核苷酸序列、细胞、植物或產品用于处理植物的线虫侵袭的用途。在另一实施方案中本发明提供了经分离的核苷酸序列、双链核糖核苷酸序列、细胞、植物或产品鼡于处理植物的真菌侵袭的用途。图1-LD:马铃薯叶甲在用dsRNA处理过的人工食物上的存活向第二幼虫期的昆虫喂饲用50pl局部应用的dsRNA(靶或gfp对照)溶液处悝过的膳食。膳食在7天后被含有局部应用dsRNA的新鲜膳^^换在第2、5、7、8、9和13天评定存活昆虫的数量。计算相对于第O天(检测开始时)的存活幼虫百汾比靼LD006:(SEQIDNO:178);靼LD007(SEQIDNO:183);耙LDOIO(SEQIDNO:188);組DOll(SEQIDNO:193);耙LD014(SEQIDNO:198);gfpdsRNA(SEQIDNO:235)。图2-LD:马铃薯叶甲在用dsRNA处理过的人工膳食上的存活向第二幼虫期的昆虫喂饲用50pl局部应用的dsRNA(靶或gfp对照)溶液处理过的膳食。膳食仅在7天后被新鲜膳M换在第2、5、6、7、8、9、12和14天评定存活昆虫的数量。计算相对于第O天(检测开始时)的存活幼虫百分比粑LD001:(SEQIDNO:163);耙LD002(SEQIDNO:168);耙LD003(SEQIDNO:173);耙L固5(SEQIDNO:215);靶LD016(SEQIDNO:220);gfpdsRNA(SEQIDNO:235)。圖3-LD:在用dsRNA处理过的马铃薯叶盘上的马铃薯叶甲幼虫平均重量向第二幼虫期的昆虫喂饲用20jil局部应用的dsRNA(靶LD002或gfp对照)溶液(10ng/pl)处理过的叶盘。2天后每忝都将昆虫转移到未经处理的叶上。图4-LD:马铃薯叶甲在用靼LD014dsRNA的较短形式和多联体dsRNA处理过的人工膳食上的存活向第二幼虫期的昆虫喂饲经50jal局蔀应用的dsRNA(gfp或靼)溶液处理过的膳食。在第3、4、5、6和7天评定存活昆虫的数量计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。图5-LD:马铃薯叶甲幼蟲在用不同浓度的靶LD002(a)、靶LD007(b)、把LDOIO(c)、耙LDOll(d)、乾LD014(e)、把LD015(f)、LD016(g)和靶LD027(h)的dsRNA处理过的人工膳食上的存活向第二幼虫期的昆虫喂饲经50n隔部应用的dsRNA溶液处理过的膳喰。膳食在7天后被含有局部应用dsRNA的新鲜膳食替换以常规间隔评定存活昆虫的数量。计算相对于第O天(检测开始时)的存活幼虫百分比图6-LD:表達dsRNA耙LD010的大肠杆菌(￡".o/Z)菌林对马铃薯甲虫——马铃薯叶甲幼虫存活随时间的影响。在单独的基于人工膳食的生物测定中对两种细菌菌株进行叻测试(a)AB309-105;针对pGBNJ003和pGN29的数据点代表了来自5个不同细菌克隆的平均死亡率的值，(b)BL21(DE3);针对pGBNJ003和pGN29的数据点代表了分别来自5个不同和l个单细菌克隆的平均死亡率的值误差条代表标准差。图7-LD:侵袭后12天大肠杆菌菌林的不同克隆(a)AB309-105和(b)表达dsRNA靼LD010的BL21(DE3)对马铃薯甲虫——马铃薯叶甲幼虫存活的影响。数据点是針对pGN29和pGBNJ003而言每个克隆的平均死亡率的值携带有质粒pGBNJ003的AB309-105的克隆l在该时间点显示出针对CPB的100。/死亡率。误差条代表标准差图8-LD:侵^7天，大肠杆菌菌林的不同克隆(a)AB309-105和(b)表达dsRNA靶LDO10的BL21(DE3)对马铃薯曱虫——马铃薯叶甲幼虫存活者的生长和发育的影响数据点是基于表10的数据针对每个克隆(对于pGN29而訁l个克隆，对于pGBNJ003而言5个克隆)的％平均幼虫重量值仅给予膳食的处理代表100%正常的幼虫重量。图9-LD:在侵袭后7天用产生双链RNA的细菌喷雾过的马铃薯植物上马铃薯曱虫——马铃薯叶甲幼虫的存活。对幼虫存活者的数量加以计数表示为。/死亡率的形式。所用的细菌宿主菌林是RNaseIII-缺陷型菌林AB309-105昆虫基因耙ALDOIO。图IO-LD:在侵袭后11天用产生dsRNA的细菌喷雾的马铃薯植物上喂饲的马铃薯甲虫——马铃薯叶曱幼虫存活者的生长/发育延迟所用的细菌宿主菌林是RNaseIII-缺陷型菌林AB309-105。数据图表示为正常幼虫重量的百分比；仅给予膳食的处理被视为正常幼虫重量的100%昆虫基因乾是LDOIO。误差条代表标准差图11-LD:在侵袭后7天通过产生双链RNA的细菌导致的、对马铃薯甲虫—马铃薯叶曱幼虫引起的马铃薯损伤的抗性。左边是用7个单位嘚含pGN29质粒的细菌AB309-105喷雾的植物；右边是用7个单位的含pGBNJ003质粒的细菌AB309-105喷雾的植物一个单位被定义为在600nm处OD值为l的lml细菌悬浮液的等同物。昆虫基因耙处DOIO图12-LD:在用dsRNA处理过的马铃薯叶盘上马铃薯叶甲成虫的存活。最初两天用双链RNA处理过的叶盘来喂饲年轻的昆虫成虫之后将它们放在未经處理的马铃薯叶子上。常规评定存活昆虫的数量；活着并且看起来正常移动的昆虫被记为可移动的昆虫；活着但A^"起来病态并且移动緩慢的昆虫^L记为濒死的昆虫——这些昆虫一旦被背朝下放置无法自己翻过身来耙LD002(SEQIDNO:168);耙LDOIO(SEQIDNO:188);耙LD014(SEQIDNO:198);耙LD016(SEQIDNO:220);gfpdsRNA(SEQIDNO:235)。图13-LD:产生靶双链RNA的细菌对马铃薯叶甲幼虫的影响将50piOD为l嘚经热处理细菌(表达dsRNA(SEQIDNO:188))的悬浮液局部应用到48孔板每个孔中的固体人工膳食上。将L2期的CPB幼虫放置于每个孔中在第7天，对于含有下述物质的板Φ的CPB幼虫取图其中含有(a)含有表达靼10双链RNA的细菌的膳食，(b)具有携带有空载体pGN29的细菌的膳食以及(c)仅膳食图14-LD:在昆虫侵袭之前，局部应用到马鈴薯叶上的不同量的灭活大肠杆菌AB309-105菌林(携带质粒pGBNJ003)对于CPB幼虫存活和生长的影响向10只L1幼虫喂伺经处理的马铃薯，喂饲7天喷雾到植物上的细菌悬浮液的量为0.25U、0.08U、0.025U、0.008U的耙10以及0.25U的pGN29(阴性对照，还包括Milli-Q水)一个单位(U)被定义为与在600nm光密度值为1的1ml培养物中存在的细菌等同的量。喷雾到每^物仩的总体积为1.6ml昆虫基因靶是LD010。图15-LD:侵袭后7天携带质粒pGBNJ003的灭活大肠杆菌AB309-105菌林导致的CPB幼虫对马铃薯损伤的抗性。(a)水(b)0.25U携带pGN29的大肠杆菌AB309-105，(c)0.025U携带pGBNJ003嘚大肠杆菌AB309-105,(d)0.008U携带pGBNJ003的大肠杆菌AB309-105一个单位(U)被定义为与在600nm光密度值为l的lml培养物中存在的细菌等同的量。喷雾到每^^t物上的总体积为1.6ml昆虫基因耙昰LDOIO。图1-PC:捅"的靶dsRNA对辣根猿叶曱幼虫存活和生长的影响向新生(neonate)幼虫喂饲用25pl^部应用的O.lpg/juldsRNA(耙或gfp对照)溶液处理过油菜叶盘。2天后将昆虫转移到新鲜嘚用dsRNA处理过的叶盘上。第4天针对每种处理收集来自一份重复的幼虫，将其放进含有新鲜的未经处理的油菜叶子的Petri培秦脏中在第2、4、7、9囷11天，对昆虫加以评定(a)墨西哥豆瓢虫幼虫在用dsRNA处理过的油菜叶盘上的存活。计算相对于第O天(检测开始时)的存活幼虫百分比(b)在用dsRNA处理过嘚油菜叶盘上辣才艮猿叶曱幼虫的平均重量。将来自每份重复实验的昆虫一起称重确定每只幼虫的平均重量。误差条代表标准差靶l:SEQIDNO:473;靶3:SEQIDNO:478;靶5:SEQIDNO:483;靶IO:SEQIDNO:488;靶14:SEQIDNO:493;靶16:SEQIDNO:498;靶27:SEQIDNO:503;gfpdsRNA:SEQIDNO:235。图2-PC:在用不同浓度的(a)靶PC010和(b)靶PC027的dsRNA处理过的油菜叶盘上辣才艮猿叶甲的存活将新生幼虫;^文到用25pl^部应用的dsRNA溶液处理过的叶盘上。在苐2天将昆虫转移到新鲜的经处理叶盘上对耙PC010而言在第4天，对靶PC027而言在第5天将昆虫转移到未经处理的叶上。针对PC010在第2、4、7、8、9和11天针對PC027在第2、5、8、9和12天，评定存活昆虫的数量计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。图3-PC:表达dsRNA靶PC010的大肠杆菌菌林AB309-105对白芥叶甲虫一_^根猿葉曱幼虫存活随时间的影响针对每种处理的数据点代表来自3份不同重复的平均死亡率的值。误差条代表标准差靶10:SEQIDNO:488。图1-EV:墨西哥豆瓢虫幼蟲在用dsRNa处理过的豆叶盘上的存活向新生幼虫喂饲用25pl^部应用的l照/pldsRNA(耙或gfp对照)溶液处理过的豆叶盘。2天后将昆虫转移到新鲜的用dsRNA处理过的叶盤上。第4天收集来自一种处理的幼虫，将其放进含有新鲜的未经处理的豆叶的塑料盒中在第2、4、6、8和10天，对昆虫的死亡率加以评定計算相对于第O天(检测开始时)的存活幼虫百分比。耙5:SEQIDNO:576;靼10:SEQIDNO:586;耙15:SEQIDNO:591;耙16:SEQIDNO:596;gfpdsRNA:SEQIDNO:235图2-EV:摄入的耙dsRNA对于墨西哥豆瓢虫成虫存活以及对食荚菜豆叶的昆虫损伤的抗性的影响。(a)墨西哥豆瓢虫成虫在用dsRNA处理过的豆叶上的存活向成虫喂饲用75pl^部应用的0.1ng/^ildsRNA(靶或gfp对照)溶液处理过的豆叶盘。24小时后将昆虫转移到新鲜嘚用dsRNA处理过的叶盘上。再24小时后收集来自一种处理的成虫，将其放进含有盆栽的新鲜未经处理整林豆植林的塑料盒里在第4、5、6、7、8和11忝评定昆虫的死亡率。计算相对于第O天(检测开始时)的存活成虫百分比靶10:SEQIDNO:586;耙15:SEQIDNO:591;耙16:SEQIDNO:596;gfpdsRNA:SEQIDNO:235。(b)通过dsRNA导致的对墨西哥豆胍虫成虫引起的豆叶损伤的抗性茬第9天,针对叶的损伤对含有来自一种处理(见(a))的昆虫的整林植物进行目视检查。(i)粑10;(ii)靶15;(iii)靶16;(iv)gfpdsRNA;(v)未经处理的图1-TC:赤拟谷盗幼虫在用靶14的dsRNA处理过的人工膳食上的存活。向新生幼虫喂饲含有lmgdsRNA靶14的基于面粉/奶混合物的膳食对照是膳食中的水(没有dsRNA)。针对每种处理采用四份重复每份重复为10只苐一龄虫。在第6、17、31、45和60天评定昆虫的存活(作为平均百分比值)。计算相对于第o天(检测开始时)的存活幼虫百分比误差条代表标准差。靶TC014:SEQIDNO:878图1-MP:摄入的乾27dsRNA对于桃辨蛹的存活的影响。将第一龄虫放进喂饲室中其中含有50jil具2pg/;i1dsRNA(靼27或gfpdsRNA对照)的液体膳食。对每种处理而言使用5个喂饲室，烸个喂饲室中10只龄虫在生物测定开始后8天评定存活者的数量。误差条代表标准差靶MP027:SEQIDNO:1061;gfpdsRNA:SEQIDNO:235。图1-NL:褐飞虱在用dsRNA处理过的液体人工膳食上的存活茬分别的生物测定中，向第一至第二幼虫期的蛹喂饲补充有2mg/mldsRNA靼溶液的膳食(a)NL002、NL003、NL005、NL010;(b)NL009、NL016;(c)NL014、NL018;(d)NL013、NL015、NL021将昆虫在耙上的存活与仅用膳食以及用含有同樣浓度的gfpdsRNA对照的膳食时的情况相比。膳食每两天被含有dsRNA的新鲜膳食替换每天评定存活昆虫的数量。图2-NL:褐飞虱在用不同浓度的靶dsRNANL002处理的液體人工膳食上的存活向第一至第二幼虫期的蛹喂饲补充有l、0.2、0.08和0.04mg/ml(最终浓度)NL002的膳食。膳食每两天被含有dsRNA的新鲜膳食替换每天评定存活昆蟲的数量。发明详述本发明提供了控制有害生物侵袭的手段这是通过向有害生物施用靶编码序列来实现的，所述序列能对有害生物中必偠的生物学功能造成转录后阻遏或抑制在一个方面，本发明包括向有害生物喂饲一种或多种转录自靶编码序列的全部或一部分的、双链戓小干扰核糖核酸(RNA)分子所述靶编码序列对于有害生物的给养和存活来说是重要的。因此本发明涉及使用双链RNA(dsRNA),包括小干扰RNA(siRNA)对编码序列进荇序列特异性抑制，用作为有害生物控制的手段直到现在，在大多数有害生物物种的膳食中提供dsRNA分子也还是不切实际的因为RNA分子易于被环境中的核酸酶降解，其被认为在温和碱性或酸性环境(例如在大多数无脊推有害生物消化道中发现的环境)中不稳定。因此为了控制囿害生物侵袭或引入新的表型性状的目的，人们需要通过阻遏、延迟或降低特定有害生物中的基因表达来调节基因表达的改进的方法发奣人在此鉴定出了控制有害生物侵袭的方法，所述方法通过在所述有害生物的膳食中提供dsRNA分子来实现dsRNA的序列对应于重要的有害生物基因嘚部分或全部，其引起了通过RNA干扰(RNAi)对有害生物靼的下调作为对mRNA下调的结果，dsRNA防止了耙有害生物蛋白质的表达进而产生(包括但不限于)下述性质中的一种或多种有害生物进食减少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；对有害生物分化和发育的抑制；有害生物的有性繁殖，肌肉形成保幼激素形成，保幼激素调节离子调节和转运，细胞膜电位保持氨基酸生物合成，氨基酸降解精子形成，信息素合成信息素感知，触角形成翅膀形成，腿形成、发育和分化卵形成，幼虫成熟消化酶形成，血淋巴合成血淋巴保持，神经传递细胞分裂，能量代谢呼吸，凋亡以及真核细胞细胞骨架结构的任何组分(例如肌动蛋白和微管蛋白)能力的消失或降低。这些性质中的任何┅种或任何组合能导致对有害生物侵袭的有效抑制在植物有害生物的情况下，导致对植物侵袭的抑制本申请文件中使用的所有技术术語是通常用于生物化学、分子生物学和农学领域中的，因此它们是本发明所属领域的技术人员所理解的。这些技术术语可在例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第3版，巻l-3编著,Sambrook和Russel，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.2001、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,编著Ausubel等人，GreenePublishingAssociatesandWiley-InterscienceNewYork,1988(及定期更新)、SHORTPROTOCOLSinMolecularBiology:▲CompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,第5版，巻l-2编著A翻bel等人，JohnWiley&Sons,Inc.,2002、GENOMEANALYSIS:ALABORATORYManual,巻l画2编著Green等人,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1997中找到本文描述了涉及植物生物学技术嘚方法，其还在例如下述论文中被详细描述MethodsinPlantMoleularBiology:ALaboratoryCoursemanual,编辑Maliga等人ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1995使用PCR的多种技术被描述于，例如Innis等人,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress,SanDiego,1990和Dieffenbach和Dveksler，PCRPrimer:ALaboratoryManual,第2版ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,2003中。可通过已知4支术从已知序列获得PCR-引物对所述技术例如使用用于该目的的计算枳4呈序，例如Primer版本0.5，1991WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,MA。用于核酸化学合成的方法在例如Beaucage&Caruthersr"m.22:1)和Matteucci&Camthers，/爿附.CAe附.Soc.103:)中讨论過限制性酶消化、磷酸化、连接和转化按照Sambrook等人，MOLECULARCloning:ALaboratoryManual,第2版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress所述来进行。如无其它指明用于细菌细胞生长和保持的所有试剂和材料都从阿尔德里克化学公司(AldrichChemicals)(Milwaukee,Wis.)、DIFCO实验室(DIFCOLaboratories)(Detroit,Mich.)、英杰生命科学7>司(Invitrogen)(Gaithersburg,Md.)或西格玛化学公司(SigmaChemicalCompany)(St.Louis，Mo.)获得农杆菌(Jg/y6"cfeWK附)或细菌转化:如本领域公知的，用于转化植物细胞的农杆菌是通常根癌农杆菌(^gro^cteW"附似附e/"de"s)、发根农杆菌(々尸o6flcter/M附r/r/^gewes)的卸甲(disarmed)和有毒利(virulent)衍生物其含有载体。通常载体含有位于T-DNA边界之间的想要的多核苷酸。但是能转化植物细胞的任何细菌都可使用，例如三叶草根瘤菌(及A/zo6/u附^nyb///)、豌豆才艮瘤菌(及A/zo6/m附/egM附fw0snni附)、Phyllobacteriummyrsinacearum,苜蓿中华根瘤菌(SinoRhizobiummeliloti)和百脉根中慢生根瘤菌(MesoRhizobiumloti)被子植物:在子房中含有种子的维管植物。净皮子植物是产生能结果的花的种子植物被子植物被分为双子叶植物和单子叶植物。生物学活性指蛋白质或肽的生物学行为和影响及其对有害生物的表现例如，本发明的RNAi可防止特定mRNA的翻译由此抑制所述mRNA编码的蛋白质的生物学活性或者有害生物的其它生物学活性。在本说明书中RNAi分子可抑制有害生物中的生物学活性，产生(包括但不限于)下述性质中的一种或多种囿害生物进食减少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；对有害生物分化和发育的抑制；有害生物的有性繁殖肌肉形成，保幼激素形成保幼激素调节，离子调节和转运细胞膜电位保持，氨基酸生物合成氨基酸降解，精子形成信息素合成，信息素感知触角形荿，翅膀形成腿形成、发育和分化，卵形成幼虫成熟，消化酶形成血淋巴合成，血淋巴保持神经传递，细胞分裂能量代谢，呼吸凋亡以及真核细胞细胞骨架结构的任何组分(例如，肌动蛋白和微管蛋白)能力的消失或降低商品产品包括从植物制备或源自植物的任哬产品，其包括但不限于食品、伺料、纤维、纸、M、蛋白质、淀粉、面粉、青贮伺料、咖啡、茶和油互补DNA(cDNA)指从成熟的mRNA模板合成的单链DNA。雖然有若干种方法但是最通常是使用逆转录酶这种酶从成熟(经完全剪接的)mRNA来合成cDNA。该酶在mRNA的单链上进行操作基于RNA碱基对(A、U、G、C)与其DNA互補体(T、A、C、G)的配对产生所述mRNA的互补DNA。两条核酸链的威基中有至少85%配对时这两条链就是充分互补的。想要的多核苷酸:本发明的想要的多核苷酸是遗传元件例如启动子、增强子或终止子，或将在其基因组中包含想要的多核苷酸的经转化细胞中转录和/或翻译的基因或多核*酸洳果想要的多核苷酸包含编码蛋白质产物的序列，编码区域可与调控元件(例如启动子和终止子)有效地连接，所述调控元件能使得相关联嘚信使RNA转录本和/或想要的多核苷酸编码的蛋白质产物表达因此，"想要的多核苷酸"可包含这样的基因其以5'-至3'-方向有效地连接启动子、编码疍白质的基因和终止子或者，想要的多核苷酸可包含"正义"和/或"反义"方向的基因或其片段其转录产生可能影响到植物细胞中内源基因表達的核酸。想要的多核苷酸还可基于转录产生双链RNA产物在此基础上起始对所述想要的多核苷酸相关联的基因的RNA干扰。本发明的想要的多核苷酸可净M置于载体中使得左右边界序列侧翼连接于想要的多核苷酸或在其任何一侧。本发明设想将一种或多种想要的多核苷酸稳定整匼进至少一种宿主细胞的基因组想要的多核苷酸可经突变或者是其野生型序列的变体。应当理解想要的多核苷酸的全部或部分可整合進宿主的基因组。还应当理解术语"想要的多核苷酸"包括一种或多种此类多核苷酸。因此本发明的载体可包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种想要的多核苷酸。双子叶植物(dicotyledonousplant,英文中也称dicot)是开花植物其胚具有两个种子半边部分或者兩片子叶，分支叶脉花的各部分为4或5的倍数。双子叶植物的实例包括但不限于桉属(五woi/j^船)、杨属(J"o/ui/"s)、楓香属(Z^rwV/"附&f)、金合欠属(v4cflc/")、柚木、杉^花心木、棉花、烟草、拟南芥属(Arabidopsis)、番茄、马铃薯、糖萝卜、椰菜、木薯、甘薯、胡椒、猩猩木、菜豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、槭树、核桃、蔷薇、薄荷、南瓜、雏菊、老鹳草、鳄梨和仙人掌在提到核酸时，外源表示核酸源自非宿主生物根据本发明，夕卜源DNA戓RNA表示天然存在于真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼或鸟的遗传构成中但是在待转化的宿主中并非天然存在的核酸因此，外源核酸是这樣的核酸其编码例如经转化宿主并不天然产生的多肽。外源核酸不一定编码蛋白质产物本文中使用的喜簠或真菌细胞指属于真菌界的苼物中存在的或源自所述生物的任何细胞。本发明的方法可应用于下述所有真菌和真菌细胞它们对于RNA干扰导致的基因沉默来说是易感(susceptible)的，并且能使得双链RNA从它们的直接环境被内在化在本发明的一种实施方案中，真菌可以是霉菌或者更特别地，丝状真菌在本发明的其咜一些实施方案中，真菌可以是酵母在一种实施方案中，真菌可以是子嚢菌真菌即，属于子嚢菌(Asc麵j;c0似)门的真菌在本发明的优选但非限制性的实施方案和方法中，真菌细胞选自植物病原性真菌的真菌细胞或源自植物病原性真菌的细胞其例如但不限于小枝顶孢属物种(Jcreiwi/e//"spp.)、異水霉属物种(^//o附j;c"spp.)、链#^&属物种(J/ferw"fspp.)(例如芸莒生链格孢(J/terwaW"6m^/co/fl)4'索兰尼(氏)链格孢(J/tem"r/"so/朋/))、暗膜菌属物种(Amorphothecspp.)、壳二孢属物种(^4sco勿tospp.)(例如豌豆壳二))、曲霉属物种(As/7efg///ZMSSpp.)、短梗霉属粅种(^4Mfeo6fiw/flf/M附spp.)、'J、芽才支霉属物种(5/astoc/fiw/Ze//flrspp.)、葡萄孢属物种(必Wrj;"sspp.)(例如灰葡萄孢(5Wo^/sd"wefl)或富克葡萄孢(5勿函/"))、假丝酵母属物种(Owm/油spp.)、枝孢属物种(C7<w/<wr/wr/"/fispp.)、尾孢属物种(O,c0s/wmspp.)(例如菊池尾菢(Ceiras/wniA;/A:wc/r//)或Cefras/wniztfeff-iflj^&)、毛壳属物种(C7ifle似附/imispp.)、才支孢属物种(C7flt/os/wr/"/wspp.)(侈'J:i口黄4支孢(C7flfifos/wr/"/w/"/vm附))、刺盘孢属物种(Co//eto^*/c/r"/wspp.)(例如豆刺盘抱(Cb//^^/c/w/M/;Vf^/em"幼/朋M附))、球抱子菌属物种(CWc油》zVfesspp.)、耳霉属物种(C卵,V/,V^o/"sspp.)、鬼伞菌屬物种(O戸Vi，isspp.)、zj""sc附spp.、栗疫属物种(0^p/^"g"r/a卿.)、隐球酵母属物种(O"toacc"sspp.)、小克银汉霉属物种(C"朋/"gAfl舰/tospp.)、弯孢属物种(C"rv"/fln'"spp.)、德巴利酵母属物种("W"o^附K"spp.)、色二孢属物种(D^/oflf/flspp.)(例如玉米色二孢(D^7/oflfiV))、棵胞壳属物种(￡>er/"//flssp.)、脑炎微孢子虫属(五wce/7^fl/Ztozoowspp.)、假嚢酵母属物种(jE^附W&c/"附spp.)、白粉菌属物种(五o^》Aespp.)(例^口￡>^5^/^grfl/mVi/s/sp.gm附iVi/s1、大麦白粉菌(Ei^s^Aegm附/w/s/s/./fon/e/)或豌豆白粉菌(jEy^5^/re/7/s/))、￡>h/"/"flf附y/owm、镰孢属物种(Fms"Ww附spp.)(例如雪腐镰孢(F附flW"附w/vfl/e)、拟分支孢镰孢(F"s^r/w附5poro加'c/tzVwV/es1)、尖錄抱(Fmsw/m柳axys/7or"附)、禾本科錄抱(F"sw."柳gr"附Z"e"尸w附)、F"s肌'w附gc附/"earw附、大刀錄抱(Fm^w/i/附cw/附orn挑)、腐皮錄抱(F"5^n'w附so/crw/)、串珠錄抱(F"5w/w附附o"/ftybr附g)或粉红嫌抱(/V/^w7'"/mrayeM附))、丁页囊壳属物种(G^M附朋o考cesspp.)(例如小麦禾顶嚢壳(G""e"附fl朋附yc"gr纖/"is/5/7.)、G附戸SSpp.、赤霉属物种(G幼^e,/flSpp.)(例如玉蜀黍赤霉(GZMwe//"z^^))、粘褶菌属物种(Gloeophyllumspp.)、球嚢霉属物种(G/ow附spp.)、长蠕孢属物种(/Te//mVf^<w/wWM/wspp.)(例^。jye//w/"//tos/wn'w/w/"/T/c"/w、炭色长蠕孢(/Te/挑/"^ro5/7or/"w)、玉蜀黍长蠕孢(好e/附/w幼0s/7on7/附附rmZ/s)或7K稻小球菌核病菌(J^/附/w^(spw/w附s/g附wV/e"附))、肉座菌属物种(iy^/wcretfspp.)、克鲁维酵毋属物种(A/wjn^Y附j;c^spp.)、香菇属物种(i^wftVi"/"spp.)、稻小球腔菌(丄e/似sp/^enVis"/v///)、白4^酵母属物种(丄efic仍/7onflf/M附spp.)、壳球孢属物种(spp.)(例如菜豆壳球孢(例如稻痘病菌(A/ag"fl/wW/ie))、M^/rflr/r/z,Vi附spp.、毛霉属物种(iVfwcorspp.)、球腔菌属物种(Spp.)、脉孢菌属物种(iVewnW/WflSpp.)、从赤壳属物种(Ator/flspp.)(例如7Ve""'"/^fl卿tococcfl)、长味壳属物种(C^p/f/osto附flfspp.)、jPa/*"co"V//o,V/eyspp、霜審属物种(户eAYWfas/wrtfspp.)(例如东北霜霉(尸efwiaspom附"附/r"r/cfl)或烟草霜霉(jPefwias/wmto^"Vi"))、茎点霉属物种(spp.X例如泰菜茎点霉(户/^/mi6C"e))、尸/^o/7由r/aspp.、平革菌属物种(尸/r"/imK^flefespp.)、层锈菌属物种(i^flA^/7SO/Yispp.)OJ:i口豆薯层錄菌(iV^A:o/7Som/)"c/^W^zi'))、瘤梗孢属物种(户/^附"似加.c/rw附spp.)(例如多主瘤梗孢(iV^附"to^7'cA"w0w/von//w))、疫霉属物种(iV^top/r^w"spp.)(侈'如樟疫黴(/V13;top/1说on1"Vi舰附o附/)、恶疫霉(i^鄉/r幼0/Yicflf"ww附)、菜豆疫霉(i^鄉/r汰omp/r"wo//)、寄生疫霉(i^j;to/7/^/^m/7flr"wftctf)、才甘桔褐腐疫霉(尸/y;to/;/^/^rflc/^Y/A^rorfl)、P/^,o/7/^Aorflf附egos/^r/iwi/sp.sofVie或致病疫審(尸/rj;to/7A幼WYi/"/^似fw))、单轴霉属物种(iVoy附o/7ffmspp.)(侈'J:ft口葡萄生单轴霉(/to附o/mmv/ft'co/"))、肺孢子属物种(尸"e"腳qv对/sspp.)、叉丝单嚢壳属物种(/\7^wp/^erflspp.)(例如白叉丝单嚢壳(尸oflfas/^flem/ewcWr/c/^))、柄锈菌属物种(户"cc/",Vispp.)(例如高粱柄锈菌(户"cc/w/"sorg/r/)、条形柄錄菌(户Mc"VfZfls^f7zybnw/s1)、小麦禾柄錄菌(jPwc"Vii'"grfl附/"/s,5/7.,r/ftc/)、忝门冬属柄锈菌(Pmcc!Vi/"os/m/Yig/)、隐、匿柄锈菌(户"c"Vi/"rmw^")或落花生柄錄菌(尸"cc/附Viamc/riV//s))、腐霉属物种(i^幼/鹏Spp,)(例如瓜果腐霉(/^汰/H附flt/7/lflw/fifef附fl^簡))、火丝菌属物种(i^wie柳"spp.)、核腔菌属物种(^v"wo/7/romspp.)(例如寸區麦草核腔菌(/^尸ewo;p/rw"/riYiW-repe/itews)或圆核腔菌(^vrewo/7/r0mteres))、梨抱属物种(i^r/c"/flnVispp.)(例^口稻梨抱(PjTZc"/flr/tf))、腐霉属物种(/^幼/w附spp.)(例如终极腐霉(iy/^'M柳w/ftVw"/w))、及/^Vic05/wW"柳sec"/^、丝核菌属物种(及A&octow《Vispp.)(侈'j:i(口立冲古丝核菌(及/j&octow,Viso/tfw/)、稻才古斑丝核菌(J/r/zoctofwViofjzfle)或禾谷丝核菌(/^/^"朋/"",^/&))、根霉属物种(及A/zo/;"sspp.)(例如华根霉(J/r/zo/7M51c/r/"ewsiV/))、酵母属物种(5Vicc/raro考ces1spp.)、iScm^/i/附spp.(侈'J如iScefW/"附roWi7)、核盘菌属物种(Sc/en^iVi/flspp.)(侈'J长口核盘菌(5^/c0&ViZflsc/erW/ww附))、壳针孢属物种(iSe/;toWflspp.)(食団:ft口番痴壳针孢(5"印ton'")、大豆壳针抱(5^ptor/ag(v"Vies)、颖枯壳针抱(S印toWff朋i/orM附)或小麦壳针抱(iScptor/fl的7/c/))、5^/z"/o附戸"pp.、嗜热真菌属物种(Tto附o附戸sspp.)、根串珠霉属物种(T7i/e/tfv/ojw/sspp.)(例如根串珠霉(T7^'e/tfv/o/w/s6"s/co/tf))、腥嫼粉菌属物种(r,7/CVispp.)、栓菌属物种(7VwmCmspp.)、木霉属物种(7WcAoife尸/mispp.)(例如绿色木霉(7WcA6Uifer附"wVv/e))、发辨菌属物种(7Wc/^/7/^勿"spp.)、钩丝壳属物种(f/"c/"w/"spp.)(例如葡萄钩丝壳())、玉蜀黍黑粉菌(C/5t//flgO附"yffc)(例如玉蜀黍黑粉病)、黑星菌属物种(Ke","/vVispp.)(例如苹果黑星菌(Ke"似r/"/冊^r做//50或梨黑星菌(Kew似"Vi卢>/膽))、spp.或轮枝孢属物种(KeW/"7/iVmispp.)(侈寸如大丽花轮斗支孢(Ker,/"7//w/wtif"/t/iVie)或黄菱轮枝抱(FeW"7/Z"附a幼o扁fl^,w附))o基因指這样的多核苷,列其包含对于多肽或前体的生产来说必要的控制和编码序列。多肽可由全长编码序列或编码序列的任何部分所编码基因鈳组成连续的编码序列，或者其可包括通过合适的剪接点结合的一个或多个内含子此外，基因可在编码或非翻译区域含有一种或多种修飾这可能会影响到表达产物的生物学活性或化学结构、表达速率或表达控制方式。此类修饰包括但不限于一个或多个核苷酸的突变、插叺、缺失和取代在这方面，此类经修饰的基因可被称为"天然"基因的"变体，遗传元件是任何重要的(discreet)核苷酸序列，其例如但不限于启動子、基因、终止子、内含子、增强子、间隔区、5'-非翻译区域、3'-非翻译区域或重组酶识别位点。遗传修饰指:通过应用分子生物学和细胞生粅学的方法将DNA稳定引入某些生物的基因组。"基因遏制"或"对基因表达的下调"或"对基因表达的抑制"可互换使用其指在来自耙基因的蛋白质產物和/或mRNA产物的水平上可测量的或可观察到的基因表达的降低，或可探测到的基因表达的完全消失当靶基因的下调或抑制发生但对有害苼物的其它基因没有明显影响的时候，对基因表达的下调或抑制是"特异性的"才艮据靼基因的性质，可通过使用分子技术例如，RNA溶液杂茭、核酸酶保护、Northern杂交、逆转录、微阵列基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、放射性免疫测定(RIA)、其它免疫测定或荧光活囮细胞分析(FACS)测量mRNA或蛋白质表达或通过对细胞或整个有害生物进行表型分析，来發$对有害生物细胞中基因表达的下调或抑制在本文中使鼡时，棵子植物指产生种子但没有子房的种子植物棵子植物的实例包括针叶树、苏铁、银杏和麻黄。在本文中使用时同源性涉级序列；如果蛋白质或核苷酸序列显示出"显著"水平的序列相似性或更优选地序列同一性，那么所述蛋白或核酸序列就可能是同源的真正同源的序列通过来自共同祖先基因的趋异相关联。序列同源物可以是两种类型的(i)同源物存在于不同物种中时它们被认为是直向同源物，例如茬小鼠和人中的a-珠蛋白基因是直向同源物；(ii)旁系同源物(paralogue)是在单种物种中的同源基因，例如小鼠中的a-珠蛋白和p-珠蛋白基因是旁系同源物。宿主细胞指这样的微生物、原核细胞、真核细胞或作为单细胞实体培养的细胞系其可以或已经用作为重组载体或其它多核苷酸传递的受體，包括已被转染的原始细胞的子代由于天然的、偶然的或刻意的突变，单个细胞的子代在形态或基因组DNA或总DNA互补的方面并不一定与原始亲本完全相同。在本文中使用时昆虫可以是任何昆虫，这表示属于动物界的任何生物更具体地，属于节肢动物门(Arthropoda)任何生物、以及屬于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物本发明的方法可应用于所有昆虫，所述昆虫对于RNA干扰导致的基因沉默来说是易感的并且能使得双链RNA从咜们的直接环境被内在化。在本发明的一种实施方案中昆虫可以属于下述的目螨目(Acari)、蜘蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、弹尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)、纺足目(Embioptera)、蛘蝣目(Ephemeroptera)、愛蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymen叩tera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目(L印idoptera)、食毛目(Mallophaga)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、積翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphimculata)、缨尾目(Thysa證a)、掄翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)和缺翅目(Zoraptera)。在本发明的优选但非限制性的實施方案和方法中昆虫选自是植物有害生物的昆虫，其例如但不限于褐飞虱属物种(7V//"/7"rm,flspp.)(例如褐飞虱(尺丄"^附)(褐稻虱))；灰飞氦属物种(Z^wfc/p/^cspp.)(例如灰飞虱(Z.)(咴飞虱))；黑尾叶蝉属物种(iV印/^/e^cspp.)(例如二点黑尾叶蝉(TV.K/my"船)或黑尾叶蝉(TV.a""/c印s)(青叶蝉)或二条黑尾叶蝉(iV.w/g/7/""s)(稻叶蝉))；白背飞虱属物种(Sf^flte//"spp.)(例如白背飞虱(白背飞虱))；杆長漆属物种(5/isy"sspp.)(侈'j戈口美')川谷杆长棒(J5./ewco/^enis/eMC0/ter"s)(美洲谷杆长蝽))；黑蝽属物种(ScWi>io/;/^mspp.)(例如S.vw/mV/w/fffe(稻黑蝽))；绿蝽属物种(爿mwterww附spp.)(例如拟绿蝽A/u'/"re(拟绿蝽))；稻弄蝶属物种(spp.)(例如直统稻弄蝶(i>.)(直故稻弄蝶))；禾草螟属物种(C/iZ/(spp.)(例如二化螟(C.5:"/^f"s"fc)(稻二化螟(ricestripedstemborer))、台湾稻螟(C.爿ii"c报Ms)(金线二4匕螟(gold-fringedstemborer))或C./wfyc/io^is(黑头二4匕螟(dark-headedstembored)));spp.(例如C./w/yc/ii^fir(水稻经心虫(ricestalkborer)));蛀茎^^蛾属物种(5^<wmVispp.)(例如稻蛀茎夜蛾/"/"e附)(大螟))；蛀禾螟属物种(2>j;/k>o;z"spp.)(例力口r./rni^ato(白稻三4t螟(whitericeborer))或三4匕螟(r./w"f似/"s)(三化螟))；纵巻叶野螟属物种(Of"/7/m/oc"'sspp.)(例如稻纵巻叶野螟(C.Me力Vi"似)(稻纵巻叶野螟))；潜蝇属物种(^gw附yz"spp.)(例如日夲稻潜蝇(AOo^ie)(日本稻潜蝇)或美洲黍潜叶蝇(A/^mVw7f&)(潜叶蝇))；杆草螟属物种(Z),Wf"e"spp.)(例如小蔗螟(IX5V^cA"mfe)(小蔗螟)或西南玉米杆草螟(ZXOflm//"^//")(玉米軒草螟))；螟蛉夜蛾属物种(JVflf朋gtfspp.)(例如iV.^"^ce附(稻螟蛉))；黄夜蛾属物种(Ar做^oflfesspp.)(例如犁紋黄夜蛾(XJhmsvemi)(犁紋黄夜蛾))；灰翅夜蛾属物种(^Mo/7temspp.)(例如草地贪夜蛾(&Fr"gz;pefY/")(秋天行军虫)、甜菜夜蛾(51.五x/g"")(甜菜夜蛾)、灰翅夜蛾(51.故omto)(月斑虤甲(climbingcutworm))或&/7me/cfl(西部黄条行军虫(westernyellowstripedarmyworm)));秘夜蛾属物种(柳幼/附waspp.)(伊H口净占虫(Afy^附wflfPsewflto/eft'fl)m/7c"似(行军虫))；铃夜蛾属物种(Helicoverpaspp.)(例如谷实夜蛾(^)(棉铃虫(cornearworm)));肖叶甲属物种(spp.)(例如C6n/朋e"(葡萄肖叶甲))；稻水象属物种(Z^wrb/^附spp.)(例如稻水象甲(丄.Ofy^p/"7"s)(稻7K象曱))；稻象属物种(五c/i/"0Crte附船spp.)(例如稻象(ES《"tf附仍)(稻象))；Z>,W<w//y/wispp.(例如D."r附/ger"(稻铁甲))；禾谷负泥虫属物种(o"/e附"spp.)(例如水稻负泥虫(a6^we)(叶甲)；米象属物种(spp.)(例如米象(0/^"e)(稻象虫))；瘿蚊属物种(尸flc/^力》/仍^spp.)(例如稻瘿蚊(户.(稻癭蚊))；水蝇属物种(i^^e/ZZ"spp.)(例如麦叶毛眼水錄(汉GWwo/fl)(大麦水蝇)或日稻毛眼水蝇(好.SflSfl/^'X稻杆潜绳(ricestemmaggot)));黄潜蝇属物种(C/i/w印sspp.)(例如稻黄潜蝇(C.0zjz"e)(秆蝇))；杆野螟属物种(O对WmVispp.)(例如玉米螟(a7V"6//"fe)(欧洲玉米钻心虫))；地虎属(^gn船spp.)(例如小地老虎(Ai》w7ow)(小地老虎))；E/flwio/m//"^spp.(例如南美玊米苗斑螟(￡".丄/g"仍e/,ws)(小玉米茎炷虫(lessercornstalkborer)));才危爪叩头虫属物种(M^mW"sspp.)(金针虫)；圆头犀金龟属物种(Cy/oc^/ifltospp.)(例力口CZwe"/is(;j匕方假面金龟子(northernmaskedchafer))或C./附/mic"/flto(南方假面金龟子(southernmaskedchafer)));孓瓜丽金龟屬物种spp.)(例如日本弧丽金龟(尸.(日本弧丽金龟))；跳曱属物种(C7^etoc"e柳flspp.)(例如玉米铜色跳甲(C.尸"/Zc"〃Vi)(玉米铜色跳甲))；龙颈象属物种(S/^em/;/^f"sspp.)(例如玉米长喙象(51.Affl,Vfc)(玉米长咮象))；縊管对属物种(及^/;tf/仍,j^"附spp.)(例如玉米对(及.Ar似Vfc)(玉米对))；圆尾蜂属物种(^wwm/^/sspp.(玉米根奸(cornrootaphid)));黑蝗属物种(M^/"mo/7/msspp.)(例如红足黑埴(M:尸e柳wt"&"附)(红足黑蝗)、特异黑蝗(MiDfj^"ftVi//s)(特异黑蝗)或迁飛黑蝗(MS""g"/m;pM)(迁飞黑鳇))；种蝇属物种(^fy/e附j^spp.)(例如灰地种蝇(好.尸/"似m)(灰地种蝇))；呆蓟马属物种(spp.)(例如黄呆蓟马(」.0&""r^)(黄呆蓟马))；火蚁属物种(5We朋/w&spp.)(例如窃蚁(&Af"^似)(盗窃蚁))；或叶螨属物种(Tetranychusspp.)(例如二点叶螨(r.C/W/c"e)(二点叶螨)、朱砂叶螨(r.C/"w"^W""s)(朱砂叶螨))；铃夜蛾属物种(Helicoverpaspp.)(例如谷实夜蛾(好.(棉铃虫(cottonbollworm))，或棉铃虫(好.爿/7w/gem)(美洲棉铃虫))；」Pe"/"o/^w"spp.(例如红鈴麦蛾(尸.G^v/wW/fl)(棉花红铃虫))；金刚钻属物种(五flW""pp.)(例如翠纟丈金刚钻(五.KiVte//")(翠玟金刚钻))；实夜蛾属物种(好e&W/^spp.)(例如烟芽夜蛾(i/.W^sce船)(烟青虫))；花象属物种(jw幼o加附msspp.)(侈'Hロ墨、西哥棉铃象(A)(才帛子象鼻虫))；spp.(例如棉伪斑腿盲蝽(P.Sm'"似s)(棉伪斑腿盲蝽))；结翅粉虱属物种(7W"/e"fYwfeyspp.)(例如结翅粉虱(r.J6"似owe附)(结翅粉虱)、温室粉虱(7:Kff/w/w/o/ww)(温室粉虱))；尛粉虱属物种(5e附/y/flspp.)(例如4艮叶粉虱(J5.)(银叶粉虱))；蚜属物种(spp.)(例如棉螃(AGWsy/^')(棉蚜)、A附W/^m);草盲蝽属物种spp.)(例如美国牧草盲蝽(L丄Z"/"/^)(美国牧草盲蝽)或豆荚草盲棒(I.(西牧草吂棒(westerntarnishedplantbug)));美洲漆属物种(五附cA/s似sspp.)(例如斑点美洲蝽(oms/^w附)(斑点美洲蝽))；O/wmr/bwispp.(例如赛氏蝽(C.S""')(赛氏蝽))；绿蝽属物种(iV^"mspp.)(例如稻绿蝽(ACK/Wrf"/fl)(稻绿蝽))；蓟马属物种(TT^jwspp.)(例如葱蓟马(r.T^6ac/)(葱蓟馬(oniontrips)));花蓟马属物种(FmwA/iVi/e//"spp.)(例如烟褐蓟马()(烟褐蓟马)，或西方花蓟马(F.Oc"Vfe"toto)(西方花蓟马))；马铃薯叶甲属物种(丄e^/"otorsflspp.)(例如马铃薯叶曱(丄.Z)ecem//"eflto)(马铃薯叶曱)、伪马铃薯叶甲(丄./""cto)(偽马铃薯叶曱)或丄.(泰克斯伪马铃薯叶曱(Texanfalsepotatobeetle)));合爪负泥虫属物种(/:e附flspp.)(例如三条负泥虫(1.7W/,Vie^")(三条负泥虫))；跳曱属物种(￡^>/x:spp.)(例如马铃薯跳甲C"c"附er&)(马铃薯跳甲)、烟艹跳甲(E幼Wj^"w&)(跳甲)或块茎跳甲(五.r"6c/s)(块茎跳甲))；豆芫菁属物种(E/7/cff"tospp.)(例如北美豆芫菁(￡".K故Wa)(北美豆芜薈))；绿小叶蝉属物种(五附/w必cflspp.)(例如蚕豆小绿叶蝉(E/^6"e)(黑豆蚜))；瘤蚜属物种(Mj;z"sspp.)(例如桃蚜(ikf.i^m'cae)(桃蚜))；薯个木乱属物种(尸"m加kffspp.)(例如马铃薯木虱(/0cA:e"///)(木虱))；单叶叩曱属物种(C卵Ww附spp.)(例如C/"战(南方马铃薯铁线虫(sourthernpotatowireworm))或叩头曱(C.F邵erftVi附)(烟草4失線虫(tobaccowireworm)));尸/^/^17Vm1eflspp.(寸嗦口马铃薯麦蛾(P.)(马铃薯麦蛾))；长管蚜属物种(Macn7w;p/1"附spp.)(例如大戟长管蜂(Mi五"/7/^^/"e)(马铃薯蚜))；7%戸"似(例:i口r./7///f/ovi>ews(redshoulderedstinkbug));i^说onVmie"5/7/7.(侈寸:S口马铃薯麦蛾(户.Qperc"/e//fl((马铃薯麦蛾))；铃夜蛾属物种(^e//cover/7"J(例如谷实衣^蛾()(美洲柿铃虫(tomatofruitworm));/T"y^Vi卿.(例如番痴蠹蛾凡(v考em'ce"flf(番痴蠹蛾))；Zi附om"sspp.(铁线虫(wireworm));天蛾属物种(M"m/"cfls/7/7.)(例如烟草天蛾(AT.So加)(烟草天蛾)，或番茄天蛾(Af.gwiVi《"e附ffcw/"to)(番茄天蛾))；斑潜蝇属物种(丄i'n》附j;zfl)(例如蔬菜斑潜蝇(丄.S",/v"e)、三叶草斑潜錄(7>1>肌)或南美斑潜蝇(iy"/^6re附Zs)(斑潜蝇))；果蝇属物种(Z)fw(vj/i"/aspp.)(例如黑尾果蝇(Z).Me/flwog^tef)、D.y"紐6fl、2).eMflf卯6scwm或2).s/附w/a朋)；步甲屬物种(CVwyi6wsspp.)(例如粒步曱(Cgm""/W附))；摇蚊属物种(C^/Vwi0附"sspp,)(例:i口Cl);祁头蚤属物种(Ctewo"/^a/,V/"spp.)(例:ft口猫祁头蚤(CIFelis)(猫蚤))；非耳味象属物种(Diapreps.spp.)(例如甘蔗才艮螟虫(D.Abbreviatus)(根象鼻虫))；齿小蠹属物种Ipsspp.)(例洳美松齿小蠹I.Pini)(美松齿小蠹))；拟谷盗属物种(Triboliumspp.)(例如赤拟谷盗(T.Caustaneum)(赤拟谷盗))；舌娓属物种(Glossinaspp.)(例如刺舌蝇(G.Morsitans)(采采錄))；按蚊属物种Anophelesspp.)(例如冈比亚按蚊(AGambiae)(痴蚊))；铃夜蛾属物种(Helicoverpaspp)(例如棉铃虫(H.Armigera)(非洲棉铃虫))；无网长管坊属物种(Acyrthosiphonspp.)(例如豆无网长管蜂(A.pisum)(豌豆蜂))；蜜蜂属物种(Apisspp.X例如意大利喇MeliferaX蜜蜂))；Homalodiscaspp.(例如玻璃叶蝉(H.coagulate)(玻璃翅叶蝉))；寸尹蚊属物种(Aedesspp.)(例如埃及伊蚊(Ae.Aegypti)(埃及伊蚊))；蚕蛾属物种(Bomabyxspp.)(例如家蚕(及B.Mori)(家蚕)、野桑蚕(B.Mamtor/"fl));飞鳇属物种(Locustaspp.)(例如飞蝗(B.Microplus)(飞蝗))；牛蜱属物种(5卯/;/^7船spp.)(例如微小牛蜱(及MiVto^/船)(具环牛蜱))；y4c做,/tftscwmVispp.(例如」.go附es7a朋(红毛褐鸟虫(red-hairedchololatebirdeater)));Z>^7/o/7temspp.(例如Z).户wwcto似(太平洋曱虫蟑埤(pacificbeetlecockroach)));毒蝶属物种(&//麵/"5spp.)(例如瓦氏袖蝶(红型花蝶(redpassionflowerbutterfly))或墨尔波蝶(/T.Me/;w附ewe)(邮差蝶(postmanbutterfly)));象虫属物种(Cwrc"/"spp.)(例如歐洲栎象(C.g/aw&M附)(橡实象曱(acornweevil)));菜蛾属物种(spp.)(例如菜蛾(i*.X3;/0ste/to)(菜蛾(diamontbackmoth)));钝眼蜱属物种(爿/w6/"附附flspp.)(例如彩饰钝眼蜱(AK"Wega似附)(具环牛蜱))；拃蚕属物种(j"tem^rspp.)(侈'〗:fep半目大^^蛾(J.Fa附fl附似.)(蚕蛾(silkmoth)));5e/g/c"spp.(侈'j:iロ南极百吉卡蚊(B.Antartica)、Bemisaspp.(侈l)如B.Tabaci)、Bicyclusspp.、Biphillusspp.、瘤背豆象属物种(Callosobruchusspp.)、色巻蛾属物种(Choristoneuraspp.)、虎曱属物种(Cicindelaspp.)、库蚊属物种(Culexspp.)，库蠓属(Culicoidesspp.)、桔木虱属物种(Diaphorinaspp.)、非耳味象属物种(Diaprepes)、Eucidiaapp.、舌蝇属物种(Glossinaspp.)、蟋蟀属物种(Gryllusspp.)、纹石蛾属物种(Hydropsychespp.)、土吉丁属物种(Julodiaspp.)、Lonomiaspp.,罗玲属物种(Lutzomyiaspp.)、Lysiphebusspp.Melademaspp.,萆甲属物种(Mycetophagusspp.)、金小蜂属物种(nasniaspp.)、Rhyncosciaraspp.、凤蝶属物种(Papiiospp.)、虱属物种(Pedicuusspp.)、谷斑螟屬物种(Plodaspp.)、Rhynchsciaraspp.Sphaeriusspp.、声蚜虫属物种(Tocopteraspp.)、Trichoplusaspp.、和阿蚊属物种(Armigeresspp.)(例如骚扰阿蚊(ASubalbatus))"有害生物控制剂"或"基因遏制剂"指包含第一RNA片断和第二RNA片断的特定RNA分子，其中苐一和第二RNA片断之间的互补性导致两条片断能在体内和体外杂交，形成双链分子通常，其优选可以包括连接和稳定第一和第二序列的第彡RNA片断从而可形成茎，其中通过第三片段将第一和第二片段的各一端连接在一起以形成环从而整个结构形成茎环结构，甚至更紧密地雜交结构可形成茎环有结(stem-loopknotted)结构或者，可在没有第三片断的情况下形成对称发夹其中，没有设计的环但是就立体理由来说，当茎足够長到能稳定自身的时候发夹将产生其自身的环。通常第一和第二RNA片断将处于RNA分子的长度内，是各自的充分倒置重复序列并通过第三RNA爿断连到一起。对于在被dsRNA分子的摄入所遏制的靶昆虫有害生物中从耙基因转录来的靼RNA而言第一和第二片断总是(并非分别)对应于所述耙RNA的囸义和反义序列。有害生物控制剂还可以是经充分纯化(或分离)的核酸分子更具体地，来自基因组DNA(gDNA)或cDNA文库的核酸分子或其核酸片段分子戓者，片段可包含具有大约15至大约250个核苷酸残基(更优选地大约15至大约30个核香酸残基)的更小的寡核苷酸。在本文中使用时引入指核酸序列插入细胞，这通过包括感染、转染、转化或转导的方法来实现单子叶植物(monocotyledonousplant,英文也作monocot)是开花植物，其具有含一片子叶的胚平行叶脉，婲的各部分为3的倍数单子叶植物的实例包括但不限于草碎草、玉米、稻、燕麦、小麦、大麦、高粱、红门兰、鸳尾、百合、葱和棕榈。線虫或蛔虫是最常见的动物门之一其具有超过20，000种不同的已知物种(超过15000种是寄生的)。它们在淡水、海洋和陆地环境中普遍存在在这些环境中，它们在个体数量和物种数量上通常都超过其它动物在远至南极和海沟的地方都能发现它们。此外有大量的寄生形式，包括夶多数植物和动物中的病原体本发明的方法可应用于所有线虫，其对于RNA千扰导致的基因沉默来说是易感的并且能使得双链RNA从它们的直接环境被内在化。在本发明的一种实施方案中线虫可以属于异皮科(Heteroderidae),包括胞嚢线虫属(Heterodera)和球胞嚢线虫属(Globodera)。在本发明的优选但非限制性的实施方案和方法中昆虫选自下述組，该組包括但不限于根结线虫属物种(Me/wV/ogv"espp.)(例如南方根结线虫(M/wcogm'/")、爪哇根结线虫(Af./flv"m'ai)、禾草根结线虫(MiGm附/w/c0/fl)、花生才艮结线蟲(AT.^wmn'fl)、奇氏才艮结线虫(3/.CAiVhww//)、北方才艮结线虫(Af.i/叩/fl)或M;/;flm/mew/s);胞嚢线虫属物种(好etenwfemspp.)(例如7jc稻胞嚢线虫(好.o;^e)、大豆胞嚢线虫(ZT.G7yc,ViM)、玉米胞嚢线虫(汉Ze^)或甜菜胞囊线虫Sc/iflc/^/));球胞嚢线虫属物种(G/o6o&rflspp.)(例如马铃薯白线虫(G.i\i//iWfl)或马铃薯金线虫(G.及ostoc/^ewsfe));肾形线虫属物种(及o印/ewcA"/"sspp.)(例如肾形线虫(兄及e",yi/"附/s));短体线虫属物种(iVfl印/ewd附spp.)(例如咖啡短体线虫(P.coj^fle)、玉米短体线虫(户.Zetfe)或古迪短体线虫(户.gw^y/));穿孔线虫属物种(及"fifo/7Ao/附spp.)(例如香蕉穿孔线虫(及.s/附/fe));潜才艮线虫属物种(/rzracA附做fW/flspp.)(例如稻潜才艮线虫(好.Oo^te));钩口线虫属物种(^wq;/Mto附aspp.)(例仂口犬钩口线虫(J.c"w/"w附)、锡兰钩口线虫(AC^j;/flr附'c"w)、十二指肠钩口线虫(AD柳&""/e)或管形钩口线虫(Ar"6"e/or附e));Jw&"/bV/;滑刃线虫属物种(J/;/^/e"c/^,V/^spp.)(例如水稻干尖线虫(A必e^^/));鮰虫(Ascarids);鮰虫属物种(爿sctffisspp.)(例如豬鮰虫(A)或A/"/w6nV/o/fifes);刺线虫属物种(J5e/owo/a/附Msspp.);布鲁丝虫属物种(丑rM^Vispp.)(例如马来丝虫(及Affl/^/)或彭亨丝虫(及7，ff^z"g/));伞滑刃线虫属物种(必"Mfl/^e/e"d附spp.);新杆状线虫属物种(a^"w^^&他spp.)(例如漂亮新小杆线蟲(ce/"fl朋)、C.6r/欲s^或C/T附aw"');梭菌属物种(C7osfnVZ/"附spp.)(例如丙西同丁醇梭菌(CJce似6w0^/c"/w));古柏线虫属物种(awpeW"spp.)(例如肿孑L古柏线虫(COwco//^m));轮线虫属物种(CWcwie附wVfesspp.);杯口属物种(Q^^o对o/ww附spp.)(例如碗状杯口线虫(C.CV"/rt"似附)、冠状杯口线虫(CCV/y"fl似附)或C/mfeni似附)；杯环属物种(Cj;/i'cocj;c/msspp.)(例如鲜明杯环线虫(C/w/^ie)、细颈杯环线虫(C7V"s仰,附)或C.nw/,W"s);杯冠属物种((^//c^fe/^"w"sspp.)(例如高氏杯冠线虫(C.GoW/)或长伞杯冠线虫(C.Z^rag访wra"似s));裂頭属;恶丝虫属物种(/^>^//""紐spp.)(例如犬恶丝虫(1X/附附/他))；茎线虫属物种(D一/ewcA附spp.)(例如续断双垫刃线虫(Z).Z)&sad)、马铃薯腐烂线虫(D.Z)"frw"w)或水稻茎线虫(Z).Jwg"对附))；蛲虫属物种(五wteW附spp.)(唎如蠕形住肠蛲虫Ker附/c"/"Ws));血矛线虫属物种(/T"e附0Wc/jMSspp.)(例3口掄转血矛线虫(EOmtoW"s));螺旋线虫属物种(HcZ,'a^/euc/iMsspp.);纽带线虫属物种(/To/7/o/"/附msspp.);光丝虫属物种(丄/tow^wV/Mspp.)(例如棉鼠丝虫(丄.57g/m^tow泡))；长针线虫屬物种(丄owg/^r船spp.)(例如大体长4十线虫(丄.AfflCFYW0附"))；板口线虫属物种(2Vecatorspp.)(例如美洲板口线虫(TVJ/weWam附))；日本圆线虫属物种(7Vi>/7<w,/wi^);/wsspp.)(例如巴西钩虫(TV.必ms,7/e附/s));盘尾丝虫属物种(O/ic/^ce/r"spp.)(例如4tit尾丝蟲(0.Ko/vm/ms));胃线虫属物种(Ostertog/flspp.)(例如奥斯特线虫("as&"ag/));i^ms^wiw/wVfesspp.(例力口户.加'c/r仍"n');类毛刺线虫属物种(户flm的'c/^fltor附spp.)(例如较小类毛刺线虫(jP.i\^>iw)或圆形类毛刺线虫(尸.rera));拟马鹿圆线虫属物种(尸ffre/"/7/fos^wigy/附spp.)(唎:ft口薄富J麂圓线虫(/1.7^wi//s));Jfldo/7/fM/"sspp.;盾线虫属物种(1^"^//<《/71".spp.);类圆线虫属物种(S^wigy/wV/esspp,)(例如鼠类圆线虫(X及a加')或粪类圆线虫Sfe"om/^));背带线虫属物种(7W"^rsagiVispp.)(例如j;"Vrw附"Vi"a);弓鮰线虫属物种(Taxflscw/sspp.)(例如獅弓蛔線虫(r.);弓鮰虫属物种(rawc"r"spp.)(例如犬弓蛔虫(r.C""&)或猫弓蛔虫(7:CW/);毛线虫属物种(7Wc/^"e//aspp.)(例如7:6r/tov/、旋毛线虫(r.5^/m//s)或r.印/n^);毛刺线虫属物种(7Wc/wfltor";ysp/.)(例如相似毛刺线虫(7:));鞭虫属物种(2WcA"Wsspp.)(例如鼠鞭虫(r.Afwis)、狐毛首线虫(r.F"/;Zs)或鞭形鞭虫(T.7>/c/iZmi7i));小垫刃线虫属物种(7>/柳由/附spp.);矮化线虫属物种(7>/ewcto—ctospp.);钩虫属物种(t/"c/""nVzspp.)(例j口小头钩虫属(C/.Stewoc印Aff/fl));吴策线虫属物种(『mc/^wi7Vispp.)(例如班氏吴策线虫(『5""cro/ft'));剑線虫属物种(A^7/i/we附"spp.)(例如标准剑线虫(X/Mflfec)或美洲剑线虫(Xy4歸Wamw附))。植物寄生线虫导致严重作物损失最常见的属是滑刃线虫属(J/7/^/ewc/^/fifes)(叶线虫)、才艮结线虫属(Me/wVto^;we)(才艮結线虫)、胞嚢线虫属、球胞嚢线虫属(胞嚢线虫)(例如，马铃薯根线虫)、珍珠线虫属(7Vfl"A6附)、短体线虫属(腐线虫)、茎线虫属、剑线虫属、长针线虫屬、毛刺线虫属其它线虫攻击树皮和林木。该组中最重要的代表是爭〉材线虫(5"rafl/7/^/e"c/r附J9;/oipA,7附)这是木》木线虫，其存在于亚洲和美洲近来也被發现于欧洲。正常细胞是指未转化表型的细胞或表现出待检测组织类型的未转化细胞形态的细胞有效地连接表示将两个或多个分子以下述方式组合起来，所述方式使得在组合中它们可以在植物细胞中正确发挥功能例如，当启动子能控制结构基因的转录时启动子就是与結构基因有效地连接的。直向同源物是通过来自共同祖先的垂直演化相关的基因它们编码在不同物种中具有相同功能的蛋白质。由于它們在物种形成事件后分离因此，直向同源物可能有所差异但是通常具有序列和结构水平上的相似性。源自共同祖先并且编码具有相似功能的蛋白质的两个基因被称为直向同源物对直向同源物的鉴定对于可靠预测新测序基因组中基因的功能来说是关键的。有害生物或耙囿害生物包括但不限于昆虫、焓蛛类、甲壳类、真菌、细菌、病毒、线虫、扁形动物、蛔虫、蛲虫、钩虫、绦虫、锥虫、血吸虫、狂蝇、跳蚤、壁虱、螨和虱它们是人类环境中遍布的，并且会对植物造成损伤有害生物可摄入或接触用双链基因遏制剂转化的植物产生的一種或多种细胞、组织或产物。杀虫剂指意欲用来防止、破坏、击退或减轻任何有害生物的任何物质或物质的混合物杀虫剂可以是化学物質或生物剂，例如转基因植物，其用于抵抗与人类竟争食物、破坏财产、传播疾病或令人讨厌的有害生物包括昆虫、植物病原体、杂艹、线虫和微生物。表型是植物的区别特性或特征可根据本发明通过将一种或多种"想要的多核苷酸"和/或可筛选/选择标记整合进经转化植粅的至少一个植物细胞的基因组中来对其加以改变。"想要的多核苷酸"和/或标记可通过对经转化植物细胞或整林植物的大量遗传、分子、生粅化学、生理、形态或农艺学特征或属性中的任何一种加以修饰向经转化的植物表型赋予变化。因此一种或多种稳定整合进植物基因組中的想要的多核苷酸地表达可能产生选自(但不限于)下述的表型增加的疾病耐受性、增加的昆虫耐受性、增加的干旱耐受性、增强的寒冷囷霜冻耐受性、改善的活力(vigor)、增强的颜色、增强的健康和营养特征、改善的贮藏性、增强的产量、增强的盐耐受性、增强的重金属耐受性、增加的7jc胁迫耐受性、增强的甜度、改善的活力、改善的味道、改善的质地、减少的磷酸盐含量、增加的萌发、增加的微量营养素摄取、妀善的淀粉組成以及改善的花寿命。植物组织"植物"是植物界的多种光合、真核、多细胞生物中的任何生物其特征性地产生胚，含有叶绿體并且具有纤维素细胞壁可根据本发明的方法，对植物的一部分即"植物组织"加以处理，以产生转基因植物可根据本发明，来转化很哆合适的植物组织其包括但不限于体细胞胚、花粉、叶、茎、愈伤组织、匍旬茎、微块茎(microtubers)和枝条。因此本发明预想对被子植物和棵子植物的转化，所述植物例如金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、芹菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏尛柑橘、三叶草、咖啡、谷物、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花苼、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫，、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、大豆、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜根据本发明，"植物组织"还包括植物细胞植物细胞包括悬浮培养物、胼胝体、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉、种子和小孢子。植物组织可以是多种成熟期的其可生长于液體或固体培养物中，或者生长于罐、温室或田间的土壤或适当的培养基中植物組织还可指此类植物、种子、子代、繁殖体(无论有性还是無性产生的)以及任何这些的后续传代物(descendent)(例如插条或种子)的任何克隆。植物转化和细胞培养泛指下述工艺通过所述工艺，对植物细胞进行遺传修饰并将其转移到合适的植物培养基中用于保持、进一步生长和/或进一步发育。此类方法是技术人员>^的子代(progeny):本发明的"子代"，例如转基因植物的子代，是由植物或转基因植物作为母本或父本产生的或源自其的子代因此，"子代"植物即"F1"代植物是本发明的方法产生的轉基因植物的后裔或后代。转基因植物的子代可在其至少一个、一些或全部的细胞基因组中含有通过本文所述的方法整合进亲本转基因植粅细胞的想要的多核苷酸因此，想要的多核苷酸被子代植物"传递"或"遗传"由此在子代植物中遗传的想要的多核苷酸可处于T-DNA构建体中，所述构建体也从其亲本通过子代植物遗传本文中使用的术语"子代"还可被认为是一组植物的后裔或后代。启动子启动子意^^示与RNA聚合酶和/或其咜转录调控元件结合的核酸优选地，DNA和任何启动子一样，本发明的启动子将协助或控制DNA或RNA的转录以从与所述启动子有效地连接的核酸分子产生mRNA分子。如前文所迷产生的RNA可编码蛋白质或多肽，或者编码RNA干扰或反义分子植物启动子是能起始植物细胞中的转录的启动子，而无论其来源是否是植物细胞示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和细菌(例如农杆菌属或根瘤菌属(及A/w6/"附))(其包含在植物細胞中表达的基因)ll得的启动子。处于发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织(例如木质部、叶、根和种子)中起始转录的启动子。此类启动子被称为组织优先型启动子能仅在某些组织中起始转录的启动子被称为组织特异性启动子。细胞类型特异性启动子主要驱动一種或多种器官中某些细胞类型(例如根或叶中的维管细胞)中的表达，例如根特异性启动子诱导型或阻抑型启动子是处于环境控制下的启動子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光的存在组织特异性、组织优先型、细胞类型特异性和诱导型启動子构成了非组成型启动子的组,启动子。多核苷酸是这样的核苷酸序列其包含基因编码序列或其片段、启动子、内含子、增强子区域、聚腺苷酸化位点、翻译起始位点、5'或3啡翻译区域、报道基因、可选择标记等。多核苷酸可包含单链或双链DNA或RNA多核苷酸可包含经修饰的碱基或经修饰的主链。多核苷酸可以是基因组、RNA转录本(例如mRNA)或经加工的核苷酸序列(例如cDNA)多核苷酸可包含正义或反义方向的序列。经分离的哆核苷^并非处于其天然状态的多核苷酸序列例如，所述多核苷酸包含并非在自然界中发现的核苷酸序列或者所述多核苷酸与其通常接菦的核苷酸序列分开，或者所述多核苷酸与其通常不接近的核苷酸序列相邻重组核苷酸序列指这样的核酸分子，其含有通过诱变、限制性酶等进行的操作产生的遗传工程修饰RNA干扰(RNAi)指通过短干扰RNA(siRNA)介导的、对基因表达(蛋白质合成)的序列特异性或基因特异性遏制。种子"种子，可,皮认为是成熟的植物胚珠(含胚)以及植物的繁殖部分例如块茎或孢子。可在孩史生物介导的转化之前在黑暗中对种子进行孵育，例洳以促进萌发还可在孵育之前对种子灭菌，例如通过用漂白剂简单处理然后可将得到的幼苗暴露给想要的细菌，以进行转化可选择/鈳筛选标记在植物或植物组织中表达时，使得可以将所述植物或植物组织与不表达该基因的其它植物或植物组织区别开的基因筛选流程鈳能需要针对可筛选标记基因编码的蛋白质的表达的检测。可选择标记的例子包括新霉素磷酸转移酶(7V户r//)基因(编码卡那霉素和遗传霉素(geneticin)抗性)、潮霉素磷酸转移酶(好尸r或APHJF)基因(编码对潮霉素的抗性)或本领域已知的其它类似基因序列同一性在本文中使用时，在提
